利用包埋菌種發(fā)酵制取氫氣的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物質(zhì)能源生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及利用包埋菌種對淀粉質(zhì)原料進(jìn)行 發(fā)酵制取氨氣的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前全球能源主要依靠煤炭、石油和天然氣等礦物燃料，運些化石燃料的燃燒已 對全球環(huán)境造成嚴(yán)重污染，甚至威脅人類自身的健康與生存。氨能是理想的清潔能源之一， 已經(jīng)引起人們的廣泛重視。就目前狀況而言，氨氣的工業(yè)化生產(chǎn)大都采用物理化學(xué)法，需要 消耗大量的電能和礦物原料，使得氨氣生產(chǎn)成本過高，從而限制了氨能的發(fā)展。另一方面， W生物質(zhì)有機物為底物，利用微生物發(fā)酵制取氨氣的方法正在吸引越來越多的關(guān)注。運是 因為生物質(zhì)發(fā)酵不但可W提供清潔的氨能源，同時還可W消除生物質(zhì)有機廢棄物對環(huán)境造 成的污染。其反應(yīng)條件溫和、能量需求小，具有無可替代的優(yōu)勢。
[0003] 在生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)氨領(lǐng)域，昂貴的原料成本和低下的產(chǎn)氨率是制約生物制氨發(fā)展和 應(yīng)用的主要因素。而淀粉質(zhì)原料是一種廉價易得的生物質(zhì)，在全球范圍內(nèi)均廣泛存在。富含 淀粉的生物質(zhì)主要有大米、玉米、小麥等糧食作物，W及馬鈴馨、山藥、馨類等根莖類作物。 例如在全世界熱帶地區(qū)廣泛種植的木馨（Manihot esculenta化ant),能在貧瘡和干旱的 ±地生長，不與糧食作物競爭種植地且產(chǎn)量很高，因而被認(rèn)為是理想的能源作物。據(jù)聯(lián)合國 糧食農(nóng)業(yè)組織（FAO)統(tǒng)計，目前全球木馨年產(chǎn)量約為2. 5億噸，產(chǎn)值約為1000億美元。目 前，木馨主要被應(yīng)用于化工和紡織領(lǐng)域，少部分被用來制取燃料乙醇。將木馨用于生物發(fā)酵 制取氨氣化2)，將為解決能源問題做出重大貢獻(xiàn)。
[0004] 就產(chǎn)氨率而言，傳統(tǒng)的利用生物質(zhì)的暗發(fā)酵產(chǎn)氨由于能源轉(zhuǎn)化效率低，產(chǎn)氨率很 低；并且，發(fā)酵殘余液中含有大量有機酸和醇類等副產(chǎn)物，既浪費了能量又污染了環(huán)境。例 如，CN 101988075A公開了一種利用專性厭氧的己氏梭菌發(fā)酵制氨的方法，在無菌厭氧條件 下，利用厭氧菌己氏梭菌JCM1408T，W蛋白腺、牛肉膏、酵母提取物等營養(yǎng)物和蒸饋水組成 的混合物為培養(yǎng)基，W葡萄糖為發(fā)酵底物，采用分批發(fā)酵和發(fā)酵的方式進(jìn)行制取氨氣。CN 102373238A公開了一種嗜熱芽抱桿菌及其在發(fā)酵產(chǎn)氨中的應(yīng)用，利用篩選出的嗜熱芽抱桿 菌菌株對污泥進(jìn)行水解預(yù)處理，再利用水解后的污泥/或有機廢棄物發(fā)酵產(chǎn)氨。上述發(fā)明 使用的均是非固定化懸浮菌種制取氨氣，上述方法均存在菌液易被洗出、菌種易流失W及 細(xì)胞濃度無法提升的缺點，制氨系統(tǒng)中的微生物酶的穩(wěn)定性較差，產(chǎn)氨率低，不利于生物制 氨的規(guī)?；凸I(yè)化發(fā)展。
[0005] 為解決上述問題，現(xiàn)有技術(shù)通過將產(chǎn)氨菌固定化至載體或介質(zhì)，克服了游離細(xì)菌 對環(huán)境敏感、性質(zhì)不穩(wěn)定、易失活或死亡的缺點，實現(xiàn)菌種的連續(xù)重復(fù)使用，提高了產(chǎn)氨反 應(yīng)的產(chǎn)率。一般說來，制備固定化細(xì)胞的方法包括包埋法、吸附法、交聯(lián)法和共價結(jié)合法， 其中包埋法的適用最為廣泛。例如，CN 1789414A公開了一種使用固定化微生物產(chǎn)氨的方 法，該方法W聚乙締醇（PVA)膠液作為介質(zhì)，對活性污泥進(jìn)行固定。運樣制備的固定化的微 生物可利用葡萄糖、薦糖、木糖和乳糖等底物產(chǎn)氨。CN 103882001A W添加了厭氧菌瓊脂和 丫-氧化侶的普通瓊脂作為介質(zhì)，對產(chǎn)氨微生物進(jìn)行改性，提高了產(chǎn)氨量、縮短產(chǎn)氨延遲時 間。上述發(fā)明均使用固定化菌種進(jìn)行單純的厭氧發(fā)酵產(chǎn)氨，而單純暗發(fā)酵產(chǎn)氨的理論產(chǎn)率 最高只有4mol/mol，所W僅僅使用暗發(fā)酵一種發(fā)酵方式，產(chǎn)氨效率不可能獲得突破性提高。
[0006] 此外，非專利文獻(xiàn)1 W加入適量海藻酸鋼、卡拉膠、活性炭的聚乙締醇作為包埋材 料，棚酸和氯化巧混合溶液作為交聯(lián)劑的固定化方法對光發(fā)酵產(chǎn)氨菌種和暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌種 進(jìn)行固定，然而包埋材料中的聚乙締醇是合成高分子材料，傳質(zhì)性能較差，對細(xì)胞活性也有 一定負(fù)面影響?？ɡz和活性炭也會影響底物的吸收效率和氨氣的釋放速度，從而影響底 物利用率和產(chǎn)氨速率。此外，該方法制備的包埋顆粒直徑約為4mm，較大的直徑同樣會影響 包埋顆粒的傳質(zhì)性能和透光性，從而影響產(chǎn)氨效率。
[0007] 可見，如何將生物制氨的理念實用化，開發(fā)穩(wěn)?。╮ubustness)、產(chǎn)氨率、產(chǎn)氨速率、 底物利用率和能量轉(zhuǎn)化效率高的方法，仍是亟待解決的技術(shù)問題。
[000引[非專利文獻(xiàn)U固定化包埋細(xì)胞顆粒暗發(fā)酵及光合產(chǎn)氨與降解特性，劉維，2009 年重慶大學(xué)碩±論文。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種利用包埋菌種對淀粉質(zhì)原料進(jìn)行發(fā)酵制 取氨氣的方法，所述方法包含如下步驟：
[0010] (1)包埋菌種的制備；利用包埋法，分別用介質(zhì)將培養(yǎng)好的暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌、光發(fā)酵 產(chǎn)氨菌包埋，并注入交聯(lián)劑，制備成固定化的暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌和固定化的光發(fā)酵產(chǎn)氨菌；
[0011] (2)淀粉質(zhì)原料的加熱糊化：將作為發(fā)酵底物的淀粉質(zhì)原料溶液加熱糊化；
[0012] (3)暗發(fā)酵產(chǎn)氨：在暗發(fā)酵反應(yīng)器中加入步驟（2)加熱糊化后的溶液，接入步驟 (1)制備的固定化的暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌和暗發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行暗發(fā)酵，將氣相產(chǎn)物（主要為&、 C〇2)導(dǎo)出；
[0013] (4)光發(fā)酵產(chǎn)氨：將步驟（3)得到的暗發(fā)酵尾液沉淀、離屯、后，作為光發(fā)酵產(chǎn)氨的 底物，接入步驟（1)制備的固定化的光發(fā)酵產(chǎn)氨菌和光發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行光發(fā)酵，將氣相產(chǎn) 物（主要為H2、C02)導(dǎo)出；
[0014] (5)純化：將步驟（3)和步驟（4)的氣相產(chǎn)物合并，并對&進(jìn)行純化。
[0015] 具體而言，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0016] 1. 一種利用包埋菌種對淀粉質(zhì)原料進(jìn)行發(fā)酵制取氨氣的方法，所述方法包含如下 步驟：
[0017] (1)包埋菌種的制備：利用包埋法，分別用介質(zhì)將暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌和光發(fā)酵產(chǎn)氨菌 包埋，并注入交聯(lián)劑，制備成固定化的暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌和固定化的光發(fā)酵產(chǎn)氨菌；
[0018] (2)淀粉質(zhì)原料的加熱糊化：將作為發(fā)酵底物的淀粉質(zhì)原料溶液加熱糊化；
[0019] 做暗發(fā)酵產(chǎn)氨：在暗發(fā)酵反應(yīng)器中加入步驟似加熱糊化后的溶液，接入步驟 (1)制備的固定化的暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌種和暗發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行暗發(fā)酵，將氣相產(chǎn)物導(dǎo)出；
[0020] (4)光發(fā)酵產(chǎn)氨：將步驟做得到的暗發(fā)酵尾液沉淀、離屯、后，作為光發(fā)酵產(chǎn)氨的 底物，接入步驟（1)制備的固定化的光發(fā)酵產(chǎn)氨菌種和光發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行光發(fā)酵，將氣相 產(chǎn)物導(dǎo)出；
[0021] (5)純化：將步驟（3)和步驟（4)的氣相產(chǎn)物合并，并對&進(jìn)行純化。
[0022] 2.如段落I所述的方法，其中，所述步驟（I)中的所述介質(zhì)為海藻酸鋼、聚丙締酷 胺或二者的混合物；和/或所述交聯(lián)劑為化〇2。
[0023] 3.如段落1或2所述的方法，其中，所述步驟（1)中，所述的暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌種為選 自于由下酸梭菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、己氏梭菌、嗜熱芽抱桿菌、熱纖維梭菌所組成的 組中的一種或幾種。
[0024] 4.如段落1-3中任一項所述的方法，其中，所述步驟（1)中，所述光發(fā)酵產(chǎn)氨菌種 為選自于紅螺菌屬、紅假單胞菌屬或紅桿菌屬細(xì)菌的一種或幾種。
[00巧]5.如段落4所述的方法，其中，所述步驟（1)中，所述光發(fā)酵產(chǎn)氨菌種為選自于深 紅紅螺菌、沼澤紅假單胞菌、芙膜紅假單胞菌、球形紅桿菌中的一種或幾種。
[0026] 6.如段落1-5中任一項所述的方法，其中，所述步驟（1)的所述包埋法為：將所述 介質(zhì)與去離子水混合后加熱溶解，冷卻至不會對菌的活性產(chǎn)生影響的溫度后，分別將溶解 后的介質(zhì)與所述暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌和所述光發(fā)酵產(chǎn)氨菌均勻混合，借助注射器注射到所述交聯(lián) 劑中，制備成固定化的暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌和固定化的光發(fā)酵產(chǎn)氨菌。
[0027] 7.如段落6所述的方法，其中，所述介質(zhì)與所述去離子水的質(zhì)量體積比為1:100~ 5:100。
[0028] 8.如段落6或7所述的方法，其中，在所述加熱溶解后，將所述介質(zhì)溶液冷卻至 30°C ~40°C。
[0029] 9.如段落6-8中任一項所述的方法，其中，對于所述暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌和所述光發(fā)酵 產(chǎn)氨菌，二者各自的種子溶液與所述溶解后的介質(zhì)的體積比均為1:1~1:3,且在二者各自 的種子溶液中，所述暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌和所述光發(fā)酵產(chǎn)氨菌的濃度均不低于2. Og/L。
[0030] 10.如段落6-9中任一項所述的方法，其中，所述化CI2溶液的濃度按w/v計為 1%~3%。
[0031] 11.如段落1-10中任一項所述的方法，其中，對于所述步驟（1)制得的所述固定化 的暗發(fā)酵產(chǎn)氨菌和所述固定化的光發(fā)酵產(chǎn)氨菌，二者的粒徑均小于3mm。
[0032] 12.如段落1-11中任一項所述的方法，其中，所述步驟（2)的所述淀粉質(zhì)原料選自 于糧食作物淀粉、根莖類作物淀粉或上述物質(zhì)的混合物；優(yōu)選地，所述糧食作物為玉米、小 麥或大米，所述根莖類作物為馬鈴馨、山藥、木馨或甘馨。
[0033] 13.如段落1-12中任一項所述的方法，其中，所述步驟（2)中，所述淀粉質(zhì)原料溶 液的濃度為5~15g/L。
[0034] 14.如段落1-13中任一項所述的方法，其中，所述步驟（2)的加熱糊化在80°C~ 120°C的高壓蒸汽鍋或者高溫烘箱中進(jìn)行。
[0035] 15.如段落1-14中任一項所述的方法，其中，所述步驟（2)的加熱糊化的時間為 5~30分鐘。
[0036] 16.如段落1-15中任一項所述的方法，其中，所述步驟（3)中所述的暗發(fā)酵培養(yǎng) 基的組成為：4g/L 蛋白腺、0. 5g/L k 半脫氨酸、4g/L 化C1、0.1 g/L MgCl2、〇. Ig/L 化C12、 I. 5g/L K2HPO4UO血維生素液、W及10血微量元素液；其中，所述維生素液的成分為： 0. 025g/L抗壞血酸、0. 02g/L巧樣酸、0.0 lg/L葉酸、W及0.0 lg/L對氨基苯甲酸；所述微量 元素液的成分為：〇. Olg/L MnCl2、〇. 05g/L aiCl2、〇. Olg/L &8〇3、0.0 lg/LCaClzW及0.0 lg/ L A化(S〇4)2。
[0037] 17.如段落1-16中任一項所