essential oil.Pest Management Science 61:1115-1121.]〇
[0005]長期依賴化學(xué)農(nóng)藥防治頓害帶來諸多問題，例如，對非靴標(biāo)生物(例如天敵慶蟲、 經(jīng)濟(jì)慶蟲等非靴標(biāo)慶蟲和人畜等)的附帶傷害、環(huán)境污染、食品安全等。近年來，大力發(fā)展的 基于天然揮發(fā)物組分的綠色防控技術(shù)顯示出較好發(fā)展?jié)摿ΑＬ镩g釋放頓蟲信息素（例如， EBF[Bruce TJA，Birkett MA，Blande J，Hooper AMfMai^tin JL,et al.(2005)Response of economically important aphids to components of Hemizygia petiolata essential oil .Pest Management Science 61:1115-1121.])或者通過基因工程改造的方式開發(fā)能夠 釋放控頓物質(zhì)的作物（例如EBF[Beale MH，Birkett MA，Bruce TJA，Chamberlain K,Field LM，et al.(2006)Aphid alarm pheromone produced by transgenic plants affects aphid and parasitoid behavior.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103:10509-10513.化 XD，Pickett J,Ma YZ,Bruce !,Napier J,Jones HD,Xia LQ(2012)Metabolic Engineering of Plant-derived(E)-^-farnesene Synthase Genes for a Novel Type of Aphid-resistant Genetically Modified Crop Plants .J. Integrative Plant Biology 54(5) :282-299.])等均是利用頓 蟲的嗅覺開展的綠色防控措施，可^擾亂頓蟲正常的化學(xué)通訊行為，即報(bào)警信息素驅(qū)避行 為，同時(shí)引誘天敵、提高為害頓蟲后代中有翅頓(遷飛頓)的比例，從而抑制為害本地的頓蟲 的種群增長，是安全、可靠代替化學(xué)農(nóng)藥防治曬害的理想選擇。但是上述措施的有效開展依 賴于環(huán)境條件的配合，風(fēng)、雨、低溫等均會(huì)降低防治效果。
[0006] Orco是昆蟲特有蛋白，W昆蟲特有蛋白為治蟲祀標(biāo)是發(fā)展昆蟲防治新途徑的重要 手段。在降低對非昆蟲類生物產(chǎn)生的負(fù)面影響的同時(shí)，調(diào)節(jié)昆蟲行為而不致死的防治效果 符合有害生物綜合防治策略（IPM)的宗旨。干擾曬蟲化CO蛋白的正常表達(dá)會(huì)影響曬蟲對嗅 覺信號物質(zhì)的嗅覺響應(yīng)，利用本發(fā)明中的SiRNA飼喂麥長管曬，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:被RNA干擾后 的曬蟲對綠葉氣味、取食誘導(dǎo)的植物次生揮發(fā)物質(zhì)及信息素等的嗅覺反應(yīng)顯著降低;對曬 蟲驅(qū)避劑E-P-法尼締化BF)的行為響應(yīng)率下降的同時(shí)。與正常曬蟲相比，EBF處理前后，RNA 干擾曬蟲后代中的有翅曬比例并不顯著上升。上述結(jié)果說明本發(fā)明的SiRNA有效地干擾了 曬蟲對寄主植物氣味、中間信息素等的識(shí)別，同時(shí)后代遷飛曬大幅度減少，將直接引起遷飛 定殖率下降和定殖后擴(kuò)散受阻。由于SiRNA的祀標(biāo)特異性，除曬蟲外的其它生物將不受影 響，可W增加曬蟲天敵昆蟲控制曬蟲的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對上述領(lǐng)域中的缺陷，本發(fā)明提供與麥長管曬化CO基因序列匹配的SiRNA序列， 通過經(jīng)口飼喂SiRNA的方法，抑制Save化CO蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，實(shí)現(xiàn)了RNA干擾(RNAi )，編碼相 應(yīng)SiRNA的DNA分子(包括麥長管曬及其他昆蟲化CO基因在內(nèi)）也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。干 擾后的麥長管曬對綠葉氣味、取食誘導(dǎo)次生揮發(fā)物、信息素等的嗅覺響應(yīng)顯著降低，從而干 擾遷飛曬(有翅曬)對寄主植物的選擇、定位；同時(shí)降低感知周圍環(huán)境氣味信息的敏感性，例 如無法及時(shí)識(shí)別其他同伴釋放的報(bào)警信息素，導(dǎo)致曬蟲對天敵的捕食等危險(xiǎn)"無動(dòng)于衷"， 因此有利于曬蟲天敵利用利它素(如報(bào)警信息素等)鎖定曬蟲并捕食;另外，RNAi處理后，長 時(shí)間、間斷式的邸F誘導(dǎo)不再顯著提高麥長管曬的有翅后代比例，從而阻礙曬蟲種群及時(shí)響 應(yīng)環(huán)境信號進(jìn)行遷飛擴(kuò)散，破壞曬蟲群體的生活史對策(r對策），使其無法迅速成災(zāi)。本發(fā) 明為通過轉(zhuǎn)基因手段開發(fā)具有上述生物學(xué)效應(yīng)的作物品種提供了寶貴的基因資源，同時(shí)也 可嘗試?yán)脟娛B透SiRNA的方式直接實(shí)現(xiàn)對害蟲祀標(biāo)基因的沉默?？蓱?yīng)用于防治曬蟲或 制備防治曬蟲的產(chǎn)品、抑制曬蟲有翅曬發(fā)生或者制備抑制曬蟲有翅曬發(fā)生的產(chǎn)品。
[000引基于麥長管曬Sitobion avenae的化CO基因設(shè)計(jì)的siRNA，命名為si化co8,其序列 如沈Q ID NO: 1所示。
[0009] 所述的SiRNA在制備防治曬蟲、干擾曬蟲化學(xué)通訊或降低曬蟲遷飛曬比率的產(chǎn)品 中應(yīng)用。
[0010] 所述的SiRNA在防治麥曬及其他具有相同基因祀標(biāo)序列的害蟲中的應(yīng)用。
[0011] 所述應(yīng)用為將權(quán)利要求1所述的SiRNA導(dǎo)入曬蟲，從而實(shí)現(xiàn)防治曬蟲、干擾曬蟲正 常化學(xué)通訊或者降低曬蟲遷飛曬比率。
[0012] 所述導(dǎo)入的方式為飼喂曬蟲。
[0013] 所述飼喂為將Si化co8溶解于人工飼料中，獲得混合溶液，用所述混合溶液飼喂曬 蟲。
[0014] 所述Si化co8在人工飼料中的濃度為20ngAU。
[0015] 所述麥曬為麥長管曬Sitobion avenae。
[0016] 本發(fā)明通過飼喂siRNA的方法，干擾Save化CO基因的轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)巧光定量PCR研究 表明，SaveOrco基因的表達(dá)明顯受到抑制。嗅覺行為反應(yīng)檢測結(jié)果顯示，Save化CO表達(dá)沉默 后的曬蟲對順-3-己締醇(綠葉氣味物質(zhì)），水楊酸甲醋(曬害誘導(dǎo)植物揮發(fā)物)和EBF(麥長 管曬報(bào)警信息素）的響應(yīng)率均顯著下降。進(jìn)一步開展EBF對麥長管曬翅型分化的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)， RNAi處理曬蟲停止了對邸F的誘導(dǎo)，沉默前后麥長管曬及其后代群體遷飛曬比例無顯著變 化。曬蟲正常的化學(xué)通訊被干擾，同時(shí)逆境誘導(dǎo)的翅芽發(fā)生也被阻止，表明化CO基因的保守 序列可應(yīng)用于通過SiRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，有效遏制曬蟲快速擴(kuò)散為害、用于防治曬蟲。
[0017] 化CO蛋白為昆蟲特有蛋白，直系同源化CO的氨基酸序列間具有較高的序列一致性 (通常超過50%)。盡管如此，不同昆蟲的化CO基因仍包含不少變異區(qū)序列。運(yùn)類變異區(qū)段是 理想的SiRNA祀標(biāo)區(qū)域，可W實(shí)現(xiàn)RNA干擾效應(yīng)的針對性、甚至實(shí)現(xiàn)"種"特異性，適合篩選用 于轉(zhuǎn)基因開發(fā)材料；W變異區(qū)為潛在作用祀標(biāo)，設(shè)計(jì)并篩選目標(biāo)受體的興奮劑或者括抗劑 等，可進(jìn)一步通過對嗅覺功能蛋白表達(dá)的調(diào)控干預(yù)祀標(biāo)昆蟲的行為，達(dá)到防控目的，是開發(fā) 直接施用藥劑、進(jìn)行有針對性地害蟲防治的寶貴資源?？傊槍ハx特有蛋白開展害蟲防 治，有望降低對非祀標(biāo)生物甚至非祀標(biāo)昆蟲的傷害，同時(shí)提高防治效果。
【附圖說明】
[0018] 圖1. RNAi干擾處理后，麥長管曬Save化CO轉(zhuǎn)錄水平被抑制情況(巧光定量PCR)，
[0019] 其中（12(H72化-RNAi干擾處理停止后，第72h Save化CO的表達(dá)情況。Oh-WRNAi干 擾處理起始時(shí)間的Save化CO表達(dá)水平為外參標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，比較不同處理時(shí)間目的基因 的相對表達(dá)情況；120h-RNAi干擾處理滿12化Save化CO的表達(dá)情況；12(H7化-RNAi干擾處 理滿12化后，第72小時(shí)Save化CO的表達(dá)情況
[0020] 圖2. RNAi干擾麥長管曬嗅覺行為反應(yīng)測定，
[0021] 圖3. EBF誘導(dǎo)處理后RNAi干擾麥長管曬的有翅曬分化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0023] 1.材料與方法
[0024] 1.1供試?yán)ハx
[0025] 麥長管曬單性系實(shí)驗(yàn)種群最初來源于廊坊野外種群，經(jīng)單頭擴(kuò)繁，飼喂于小麥植 株，小麥品種是中麥175。選擇低密度（10株麥苗/盆、平均1頭/株麥苗)飼喂3代W上的麥長 管曬成蟲及其后代做為試蟲。飼養(yǎng)溫度保持在22±rC，相對濕度75%，光周期16h:化。
[0026] 1.2 SiRNA序列設(shè)計(jì)
[0027] WSaveOrco的cDNA(Genbank登錄號：GQ275379)為模板，根據(jù)SiRNA序列設(shè)計(jì)原則 設(shè)計(jì)并合成SiRNA,命名為Si化co8,分別W打亂順序的SiRNA作為陰性對照，命名為 Neg化co8。序列內(nèi)容見表1。
[002引 表1. SiRNA序列內(nèi)容
[00901
[0030] 1.3飼喂法RNAi干擾實(shí)驗(yàn)
[0031] 麥長管曬人工飼料經(jīng)0.22皿濾膜過濾處理后，用于溶解SiRNA，濃度為20ngAU。飼 喂法RNAi干擾實(shí)驗(yàn)取高6cm、直徑2.5cm的通透玻璃管，一端附兩層充分拉伸的石蠟?zāi)?，在?間注入含SiRNA的10化1人工飼料，朝上放置。另一端W紗布包裹，保持通氣；設(shè)純?nèi)斯わ暳?作為空白對照，同時(shí)設(shè)20ngAil的化gOrco為陰性對照。每玻璃管接入10頭成曬，飼喂時(shí)間持 續(xù)12化，進(jìn)行S次平行實(shí)驗(yàn)。人工飼料飼喂?jié)M12化后，收集曬蟲準(zhǔn)備下一步實(shí)驗(yàn)。其中，第 7化時(shí)更換新鮮人工飼料。
[0032] 1.4巧光定量PCR
[0033] 利用SYBR Green qPCR技術(shù)檢測RNAi干擾處理0h、24h、4化、7化、9化和120h的麥長 管曬成蟲(30頭)SaveOrco表達(dá)量，引物序列見表2。同時(shí)，檢測RNAi干擾處理結(jié)束轉(zhuǎn)接麥苗 后第7化麥長管曬Save化CO的表達(dá)量。
[0034] 表2.引物列表(名稱、序列內(nèi)容、擴(kuò)增區(qū)域、擴(kuò)增片段長度、退火溫度）
[0035]
[0036] 快速切取并收集麥長管曬觸角于1.5ml離屯、管。電動(dòng)組織研磨器研磨處理，提取總 RNA并合成第一鏈cDNA。具體步驟見總RNA提取試劑盒(PureLink RNAMini Kit,Ambio