專利名稱：miRNA-140抑制劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域及心臟疾病的診斷、預(yù)防和治療領(lǐng)域，涉及一種內(nèi)源性的非編碼小RNA抑制劑的新用途，具體涉及一種miRNA-140抑制劑及其用途，具體為其在診斷、預(yù)防和/或治療心臟疾病中的用途。
背景技術(shù)：
目前，心血管疾病是人類健康和生命的主要威脅，是人類健康的頭號(hào)殺手，全世界范圍內(nèi)每年有一千七百萬人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和。在我國，隨著人民生活水平日益提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢，已超過癌癥成為第一大致死原因。根據(jù)國家衛(wèi)生部2004年底公布的最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，我國18歲及以上居民高血壓患病率為18.8%，估計(jì)全國患病人數(shù)超過1.6億，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病以及心力衰竭等凋亡相關(guān)心臟疾病的病人達(dá)幾千萬。目前關(guān)于心臟疾病發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚，心臟疾病的預(yù)防、診斷和治療尚不能達(dá)到讓人滿意的效果，急需開發(fā)新的技術(shù)、方法用于心臟病的診斷、預(yù)防和治療。miRNA是新近研究發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子。許多研究表明，miRNA對(duì)于維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常表達(dá)與許多心臟疾病的發(fā)生相關(guān)。因此，將miRNA作為心臟疾病治療的靶點(diǎn)，開發(fā)相關(guān)藥物具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。單一的miRNA可以同時(shí)作用于多個(gè)祀基因的mRNA的表達(dá),這樣藥物作用于一個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)參與心臟發(fā)病基因的表達(dá)，影響多個(gè)信號(hào)通路，從整體上達(dá)到治療疾病的目的。由于miRNA在心臟病理狀態(tài)下表達(dá)水平不同，因此可以通過檢測miRNA的表達(dá)水平來預(yù)測和診斷疾病。細(xì)胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細(xì)胞死亡，是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自·己結(jié)束生命的過程。它是一個(gè)主動(dòng)的、高度有序的、由基因控制及一系列酶參與的過程，對(duì)正常胚胎發(fā)育，維持細(xì)胞群體及惡性病變過程中均起重要作用，在保證多細(xì)胞生物的健康生存過程中扮演著關(guān)鍵的角色。在許多心肌損傷或心臟病理狀態(tài)下，如心肌缺血再灌注損傷、心臟肥厚、心力衰竭等，心肌細(xì)胞都會(huì)發(fā)生凋亡。由于成熟的心肌細(xì)胞不能分裂增殖，心肌細(xì)胞過度凋亡必然會(huì)使心肌細(xì)胞數(shù)目減少，這一點(diǎn)可能是一些心臟疾病發(fā)病的機(jī)理。目前研究發(fā)現(xiàn)許多miRNA通過調(diào)控凋亡相關(guān)靶蛋白的表達(dá)而參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。尋找心臟中特異表達(dá)的、參與心肌細(xì)胞凋亡的miRNA,闡明其作用機(jī)理，對(duì)于開發(fā)以miRNA為策略的心臟疾病的診斷、預(yù)防和治療具有極其重要的意義和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是確定或發(fā)現(xiàn)調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的miRNA-140及其抑制劑，并且進(jìn)一步確定其在心肌缺血再灌注、心肌梗死、冠心病等心臟疾病中的關(guān)鍵作用，將其應(yīng)用到這些心臟疾病的診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評(píng)估中。本文定義的術(shù)語具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。除非另外說明，本文中的miR-140是指miRNA-140 ；miR-140抑制劑是指miRNA-140 抑制劑。除非另夕卜說明，本文中的miRNA-140的序列為SEQ ID NO:2(5' -CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG-3')所示的核苷酸序列。除非另外說明，本文中的“偽手術(shù)”是指除了不結(jié)扎穿過左前降支的結(jié)扎線外剩下的所有手術(shù)步驟都與缺血/再灌注組相同。除非另外說明，本文中的“缺血/再灌注”是指結(jié)扎小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支造成心肌缺血一段時(shí)間之后，松開結(jié)扎線使心肌達(dá)到再灌注。除非另外說明，本文中的“危險(xiǎn)區(qū)/左心室”是指“危險(xiǎn)區(qū)總面積/左心室面積”。除非另外說明，本文中的“梗死區(qū)/危險(xiǎn)區(qū)”是指“梗死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)總面積”。除非另外說明，本文中的“梗死區(qū)/左心室”是指“梗死區(qū)面積/左心室面積”。針對(duì)上述目的，本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種miRNA-140抑制劑，所述抑制劑的序列為與下述SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列至少有90%同源性的序列:5' -CUACCAUAGGGUAAAACCACUG-3'，其中每一個(gè)堿基均進(jìn)行了 2' -O-甲基修飾。優(yōu)選地，所述抑制劑的序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其中每一個(gè)堿基均進(jìn)行了 2' -O-甲基修飾，甲氧基修飾能夠增加抑制劑的穩(wěn)定性(GenePharma C0.Ltd))。再一方面，本發(fā)明提供一種miRNA-140抑制劑在制備用于診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評(píng)估心臟疾病的藥物或試劑盒的用途。優(yōu)選地，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、冠心病、心臟肥厚和心肌纖維化中的一種或多種。又一方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的本發(fā)明上述所述的miRNA-140抑制劑和藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料。優(yōu)選地，所述有效量的miRNA-140抑制劑為20_200mg/kg。優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體和納米顆粒中的一種或多種。優(yōu)選地，所述藥物組合物為口服制劑或注射制劑。還一方面，本發(fā)明提供一種用于診斷和/或預(yù)后評(píng)估心臟疾病的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明上述所述的miRNA-140抑制劑或用于特異性檢測miRNA-140的探針或引物，所述引物為SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。綜上所述，本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)證明miRNA-140抑制劑在心肌缺血損傷及心肌細(xì)胞凋亡中的變化及其心肌保護(hù)作用。具體地，本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-140在心肌缺血損傷及缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中miRNA-140表達(dá)顯著上調(diào)。通過合成miRNA-140特異性抑制劑降低其內(nèi)源性表達(dá)可以抑制心肌細(xì)胞凋亡及心肌缺血損傷，心肌梗死面積減少。心肌缺血/再灌注損傷后，抑制miRNA-140內(nèi)源性表達(dá)可以減輕缺血/再灌注損傷所致 的凋亡，減小心肌梗死面積，可改善缺血/再灌注損傷所致的心功能失調(diào)，檢測指標(biāo)包括LVEDP(左室舒張末壓)，±dp/dt max(左室壓力上升和下降最大變化速率)和LVEF(左室射血分?jǐn)?shù))。miRNA-140抑制劑通過抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟具有保護(hù)作用，miRNA-140抑制劑對(duì)許多心臟疾病具有潛在的預(yù)防和治療價(jià)值。而給予miRNA-140腺病毒增加miRNA-140表達(dá)則可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，心肌缺血損傷會(huì)更加嚴(yán)重。由此可見，本發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-140抑制劑(SEQ ID NO:1:5丨-CUACCAUAGGGUAAAACCACUG-3丨，其中所有的堿基都進(jìn)行了 2' -O-甲基修飾)通過抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟具有保護(hù)作用。心肌細(xì)胞缺氧或心肌缺血損傷過程miRNA-140表達(dá)顯著上調(diào)，miRNA-140的上調(diào)可能誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。miRNA-140在缺血/再灌注動(dòng)物模型的心肌組織中表達(dá)上調(diào)，注射miRNA-140抑制劑降低其內(nèi)源性表達(dá)，可以抵抗心肌缺血/再灌注損傷，心肌梗死面積減少，心功能顯著改善、心肌纖維化及心臟結(jié)構(gòu)重塑均在一定程度上被抑制。將miRNA-140抑制劑與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合形成藥物，導(dǎo)入心臟或體內(nèi)，對(duì)許多心臟疾病將具有預(yù)防及治療作用。發(fā)明人通過化學(xué)合成miRNA-140抑制劑從冠狀動(dòng)脈注射入小鼠心臟，發(fā)現(xiàn)心肌缺血損傷程度明顯被抑制，在動(dòng)物模型證明了 miRNA-140抑制劑對(duì)缺血性心臟病的治療作用。因此，本發(fā)明提供了將miRNA-140抑制劑與適當(dāng)載體或輔料如殼聚糖、膽固醇、月旨質(zhì)體、納米顆粒等包裝形成藥物，通過口服、靜脈注射、肌肉注射、冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射或直接心肌注射的方式，用于預(yù)防和/或治療心臟疾病、改善心臟功能、阻止心肌纖維化及心肌重構(gòu)的發(fā)生。此外，本發(fā)明還提供了采用包含特異性檢測微小RNA的探針或引物的試劑盒，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、納米微球技術(shù)檢測患者外周血血漿中miRNA-140的表達(dá)水平，用于對(duì)心肌梗死、冠心病、心肌纖維化等心臟疾病的診斷和/或預(yù)后評(píng)估。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:圖1A為過氧化氫處理誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡情況；圖1B為過氧化氫處理誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中miRNA-140表達(dá)水平的變化；圖2A為miRNA-140抑制劑處理對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的miRNA-140水平的表達(dá)變化情況；圖2B為miRNA-140抑制劑處理對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的情況；圖3為轉(zhuǎn)染miRNA-140過表達(dá)腺病毒對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡情況的影響；圖4為缺血/再灌注損傷及miRNA-140抑制劑處理對(duì)miRNA-140表達(dá)水平的變化情況；圖5A為miRNA-140抑制劑對(duì)缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響的免疫熒光結(jié)果，其中的TUNEL為通過原位末端缺口標(biāo)記法檢測心肌細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)組，DAPI為將該試驗(yàn)組的細(xì)胞進(jìn)行DAPI染核作為對(duì)照的試驗(yàn)組；圖5B為miRNA-140抑制劑對(duì)缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響的柱狀統(tǒng)計(jì)圖；圖6為小鼠靜脈注射miRNA-140抑制劑抑制內(nèi)源性miRNA-140后缺血/再灌注24時(shí)心肌梗死面積的情況，圖中的心臟橫截面切片依次為偽手術(shù)、PBS+缺血/再灌注、陰性對(duì)照+缺血/再灌注、miRNA-140抑制劑+缺 血/再灌注處理后的小鼠心臟的中乳頭肌水平的橫截面切片；
圖7為小鼠靜脈注射miRNA-140抑制劑抑制內(nèi)源性miRNA-140后缺血/再灌注一周時(shí)心功能狀況，其中圖7A為左室收縮內(nèi)徑(LVIDs)結(jié)果，圖7B為左室舒張內(nèi)徑(LVIDd)結(jié)果，圖7C為短軸縮短率(FS)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非特別說明，以下各實(shí)施例中使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物S-D大鼠、小鼠(其品種為C57BL/6小鼠)均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；提取總RNA使用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)，實(shí)時(shí)突光定量PCR技術(shù)檢測miRNA-140的表達(dá)水平的方法參見Chen, C.,等.Real-time quantification ofmicroRNAs bystem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res 33，el79，2005。除非特別說明， 以下各實(shí)施例中所用的TUNEL法參見:Anti_apoptoticeffects ofrosiglitazone in hypercholesterolemic rabbits subjected tomyocardial ischemiaand reperfusion.Cardiovasc Res.2004 ；62:135-144。除非特別說明，以下各實(shí)施例中所用的陰性對(duì)照為下述SEQ ID NO:4所示的核苷酸:5, -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3,。實(shí)施例1.心肌細(xì)朐凋亡實(shí)駘樽型中miRNA-140表汰情況對(duì)于心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，參照文獻(xiàn)von Harsdorf R, Li PF,Dietz R.Signaling pathways in reactive oxygen species-1nducedcardiomyocyteapoptosis.Circulation.99, 2934-2941 (1999)中記載的方法培養(yǎng)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，100 μ mo I/L過氧化氫加0.1mM硫酸亞鐵處理心肌細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)，提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測miRNA-140的表達(dá)水平。如圖1A所示加入過氧化氫后，心肌細(xì)胞隨著處理時(shí)間的增加凋亡加??；如圖1B所示，miRNA-140表達(dá)水平在過氧化氫處理0.5 2h內(nèi)顯著上調(diào)。實(shí)施例2.miRNA-140抑制劑抑制心肌細(xì)朐凋亡的實(shí)駘本實(shí)施例中以原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為模型，檢測miRNA-140抑制劑(antagomir)(即miRNA-140反義核苷酸序列:5^ -CUACCAUAGGGUMAACCACUG-3'，其中所有的堿基都進(jìn)行了 2' -O-甲基修飾(SEQ ID NO:1)，其由GenePharma有限公司合成)或陰性對(duì)照(序列為 5' -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3' (SEQ ID NO:4)，其由 GenePharma 有限公司合成)是否能夠抑制心肌細(xì)胞的凋亡。轉(zhuǎn)染以上所述的化學(xué)修飾的miRNA-140抑制劑于心肌細(xì)胞，以抑制內(nèi)源性的miRNA-140, 24小時(shí)后，100 μ mo I/L過氧化氫加0.1mM硫酸亞鐵處理心肌細(xì)胞I小時(shí)后換成不含過氧化氫及硫酸亞鐵的正常培養(yǎng)液，使用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡情況。如圖2A所示加入miRNA-140抑制劑后，過氧化氫處理后的心肌細(xì)胞的miRNA-140表達(dá)水平明顯下降；如圖2B所述，顯示miRNA-140抑制劑可以顯著抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。實(shí)施例3.miRNA-140腺病毒的構(gòu)律本實(shí)施例構(gòu)建了 miRNA-140腺病毒，并用該腺病毒感染原代心肌細(xì)胞，研究過表達(dá)miRNA-140對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。1.miRNA-140腺病毒的構(gòu)建采用Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV系統(tǒng)構(gòu)建miRNA-140過表達(dá)載體或腺病毒。按照公司說明書構(gòu)建相應(yīng)載體及腺病毒，具體方法如下。使用組織基因組提取試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)，提取大鼠心臟組織基因組DNA，以大鼠基因組為模板，PCR擴(kuò)增miRNA-140的全長編碼序列(SEQ IDNO:3:GTGTCTCTCTCTGTGTCCTGCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGGTTACATCATGCTGTTCTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGGATACTGGAGCACC)及其上下游兩端各將近200個(gè)bp的序列，PCR引物設(shè)計(jì)如下:上游引物5' -TGAAAGAACCCAGAGCAATG-3' (SEQ ID NO:5)，下游引物5' -TCAACTGTCACCCACCCAAC-3' (SEQ ID NO:6)擴(kuò)增片段約600bp(SEQ ID NO:7:TGAAAGAACCCAGAGCAATGTGCTGCCCTCACCCTATACAAGTTAACAGCTCTGTGGGAAAGCATCACCTCGTACAACAGTCAGAGGGTTCTAGCAGTGGGAAGGAGCTTGTTGGCTGTGATAACCTCTTATCCTGCTGACCTTGTGGTGCGGGGATATCTTCTGGCTTGGTGTTGGGCTCCCCCGCCTCTGATCCTATTTGCGGTGGTGTAGTCTTCTGTGTTGATCCCATCCTGCAGATGAATTGTTCTTTTTTCCGTGGTGACCTCTCCAGGCTGTGCTTGGTGGGCATCTGGTGTGGCTCCCGCCCTGTGTGTCTCTCTCTGTGTCCTGCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGGTTACATCATGCTGTTCTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGGATACTGGAGCACCCTCTGCATCGAAGGACTCCATCTACACAGCCACACACAGCCCAGCAGCCAGGGGCCGGCTCCCTTGACCTCTGTTCCCTGACTGTTTAGCTCAAACTCTGAAGGACTCTGGATTCTGGCTTGAGGATTCTATGTAGGATGCAGATAGATGCTAAGGCGTCTGTTGGGTGGGTGACAGTTGA，其中標(biāo)下劃線的部分為上下游引物，下游引物與該序列的C末端序列反向互補(bǔ)，加黑標(biāo)下劃線的部分為SEQ ID NO: 3的序列，其余為上下游各近200bp的序列)。PCR 反應(yīng)體系如下:10 X buffer (加有 Mg2+) 5 μ L，dNTP (2.5mM) 8 μ L，上游引物(IOMm) 2 μ L，下游引物(10 μ Μ) 2 μ L，Taq (5U/μ L) 0.5 μ L，模板 I μ L，雙蒸水補(bǔ)齊至 50 μ L0PCR反應(yīng)條件如下:95°C預(yù)變性5min，95°C變性lmin，58°C退火50s，72 °C延伸lmin, 25個(gè)循環(huán)，72°C總延伸IOmin0將該片段克隆入T載體,亞克隆入pSilencer Adeno CMV1.0穿梭載體(pSilencerAdeno CMV1.0 shuttle vector載體)Xho I和Spe I雙酶切位點(diǎn)間。Pac I酶切線性化該載體及腺病毒骨架(Adenovirus LacZ Backbone),共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞(購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC))包裝腺病毒，擴(kuò)增收集病毒，測定病毒滴度。Real-time PCR鑒定miRNA-140 有表達(dá)。2.感染原代心肌細(xì)胞參照Tan, ff.Q., Wang, K., Lv, D.Y.& Li, P.F.Foxo3a InhibitsCardiomyocyteHypertrophy through Transactivating Catalase.J Biol Chem283,29730-29739(2008),用miRNA-140腺病毒感染原代心肌細(xì)胞24小時(shí)后，過氧化氫處理心肌細(xì)胞后，TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡情況。如圖3顯示，感染miRNA-140腺病毒的心肌細(xì)胞，凋亡比例顯著升高。實(shí)施例4.抑制內(nèi)源件miRNA-140可改善缺血再灌灃所致的心肌細(xì)朐凋亡、心肌棰死面積的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小鼠尾靜脈20mg/kg注射miRNA-140抑制劑(即miRNA-140反義核苷酸序列，即5' -CUACCAUAGGGUAAAACCACUG-3'，其中所有的堿基都進(jìn)行了 2' -O-甲基修飾(SEQ IDNO:1))或陰性對(duì)照(序列為 5' -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3' (SEQ ID NO:4))，3 天后進(jìn)行心臟缺血/再灌注手術(shù)，具體操作如下:小鼠稱重并麻醉，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)用木板上，并進(jìn)行心電圖監(jiān)測。剪毛并用碘酒消毒手術(shù)區(qū)。頸部正中切開氣管并插管，連動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行正壓通氣，在胸骨左緣處及心臟搏動(dòng)處縱行切開皮膚約2cm，逐層鈍性分離皮下組織、肌肉，開胸，小心提起心包并剪開，充分暴露心臟、血管。在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，于左心耳根部下方2mm處進(jìn)針，進(jìn)針深度0.5mm ;以8/0帶針縫合線穿過心肌表層，在肺動(dòng)脈圓椎旁出針；待心電圖恢復(fù)穩(wěn)定IOmin后，予以結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)。以I導(dǎo)聯(lián)ST段(心肌缺血時(shí)心電圖典型表現(xiàn)為ST段抬高，如果ST段弓背向上抬高表達(dá)心肌缺血手術(shù)成功)弓背向上抬高大于0.1mv并持續(xù)0.5小時(shí)以上作為結(jié)扎成功的標(biāo)志。缺血45min之后，松開結(jié)扎線開始再灌注。以ST段下降為標(biāo)志。清除胸腔內(nèi)積血并用去針頭注射器抽吸氣體關(guān)閉胸腔。再灌注3小時(shí)，采用TUNEL檢測試劑盒(Roche公司)通過原位末端缺口標(biāo)記法(TUNEL法)監(jiān)測心肌細(xì)胞凋亡。再灌注24小時(shí)，用伊文斯藍(lán)(Evans blue)/TTC雙染測定心肌梗死面積。具體方法如下:心肌缺血/再灌注模型建立24小時(shí)后，重新結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，注射2 %伊文斯藍(lán)(Evans blue)，取出心臟，用生理鹽水洗去血液后，稱取全心重和心室重量，沿著垂直于左室長軸的方向?qū)⒆笮氖覚M切成5片切片，置于37°C。1% TTC(氯化三苯基四氮唑)磷酸緩沖液中染色15min，數(shù)碼相機(jī)記錄每片心肌的情況。心肌梗死面積按如下方法計(jì)算:左心室面積(left ventricle, LV)為藍(lán)色、紅色和白色面積之和；危險(xiǎn)區(qū)總面積(area at risk,AAR)為紅色和白色面積之和；梗死區(qū)面積(infarct area, INF)為白色面積。危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR/LV, % )=(危險(xiǎn)區(qū)總面積/左心室面積)X 100% ;心梗面積(INF/AAR，% )=(梗死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)總面積)X 100%。

實(shí)時(shí)定量PCR檢測了心肌組織中miRNA-140表達(dá)水平，如圖4的結(jié)果顯示，miRNA-140抑制劑可有效抑制心肌組織中的miRNA-140的表達(dá)。與陰性對(duì)照注射組相比，miRNA-140抑制劑缺血/再灌注(Ι/R)組心肌梗死面積顯著降低(圖6)，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(圖5)，說明抑制內(nèi)源性miRNA-140可減輕缺血/再灌注所致的心肌細(xì)胞凋亡、心肌梗死面積。實(shí)施侈il 5.miRNA-140 zTO吿ι|齊1|倉^:夠改善尤、功倉阻ihbfl莊結(jié)構(gòu)重塑的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)iiH參照實(shí)施例4的方法，靜脈注射miRNA-140抑制劑或陰性對(duì)照連續(xù)3天后對(duì)進(jìn)行
心肌缺血/再灌注手術(shù)。缺血/再灌注一周時(shí)使用超聲心動(dòng)圖檢測缺血/再灌注損傷所誘導(dǎo)的小鼠心臟的結(jié)構(gòu)及功能重塑程度。具體方法參見:Lin, Z.,等.miR-23afunctions downstreamof NFATc3 to regulate cardiac hypertrophy.Proc NatlAcad Sci USA 106，12103-12108 (2009)和 Dolber，P.C.，Bauman，R.P.，Rembert, J.C.& Greenfield, J.C.，Jr.Regional changes in myocyte structure inmodel of canine right atrialhypertrophy.Am J Physiol 267，H1279-1287(1994)。 結(jié)果如圖7所不，檢測指標(biāo)包括左室舒張內(nèi)徑(LVIDd)(圖7A)、左室收縮內(nèi)徑(LVIDs)(圖7B)和短軸縮短率(FS)(圖7C)。表明與陰性對(duì)照處理小鼠I/R(缺血/再灌注)組相比，miRNA-140抑制劑處理小鼠Ι/R(缺血/再灌注)組的左室舒張和收縮內(nèi)徑都顯著減小，而短軸縮短率則顯著升高，說明抑制內(nèi)源性miRNA-140的表達(dá)能夠減輕缺血/再灌注所致的心臟結(jié)構(gòu)和功能惡性重塑。`
權(quán)利要求
1.一種miRNA-140抑制劑，所述抑制劑的序列為與下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少有90%同源性的序列: 5' -CUACCAUAGGGUAAAACCACUG-3'，其中每一個(gè)堿基均進(jìn)行了 2' -O-甲基修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的miRNA-140抑制劑，其特征在于，所述抑制劑的序列為SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，其中每一個(gè)堿基均進(jìn)行了 2，-O-甲基修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的miRNA-140抑制劑在制備用于診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評(píng)估心臟疾病的藥物或試劑盒的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述心臟疾病選自心肌梗死、心肌缺血損傷、冠心病、心臟肥厚和心肌纖維化中的一種或多種。
5.一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的權(quán)利要求I或2所述的miRNA-140抑制劑和藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述有效量的miRNA-140抑制劑為20_200mg/kg。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體和納米顆粒中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)中所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為口服制劑或注射制劑。
9.一種用于診斷和/或預(yù)后評(píng)估心臟疾病的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1或2所述的miRNA-140抑制劑或用于特異性檢測miRNA-140的探針或引物，所述探引物為SEQID NO:5或SEQ ID NO:6所·示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種miRNA-140抑制劑及其用途，所述抑制劑的序列為與下述SEQ ID NO1所示的核苷酸序列至少有90％同源性的序列5′-CUACCAUAGGGUAAAACCACUG-3′，其中每一個(gè)堿基均進(jìn)行了2′-O-甲基修飾；所述miRNA-140抑制劑在制備用于診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評(píng)估心臟疾病的藥物或試劑盒的用途。本發(fā)明證明miRNA-140抑制劑在心肌缺血損傷及心肌細(xì)胞凋亡中的變化及其心肌保護(hù)作用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103243091SQ201210026058
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月7日
發(fā)明者李培峰, 焦建琴, 李艷蕊 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院動(dòng)物研究所