澤漆提取物及制備方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及中草藥提取物及其應(yīng)用,具體設(shè)及澤漆提取物的提取方法優(yōu)選,有效 部位篩選,提取物的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 澤漆巧uphorbia helioscopia L.)又名貓眼草、五朵云、五鳳草,為大戟目大戟科 一年生或兩年生草本植物,分布于除新疆、西藏W外的全國(guó)各省區(qū),資源豐富。澤漆味辛、 苦,性微寒,全草入藥,主治水氣腫滿,疲飲喘咳追疾,菌頻,療痛,結(jié)核性擾管,骨髓炎。(江 蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上冊(cè).上海:上海人民出版社,1977:1464-1465)研究表明澤漆 具有抗腫瘤,抑菌殺蟲,止咳平喘等藥理作用(楊莉,陳海霞,高文遠(yuǎn).澤漆化學(xué)成分及其藥 理作用研究進(jìn)展[J].中草藥,2007,38(10): 1585-1589)。
[0003] 澤漆所含的化學(xué)成分種類較多,文獻(xiàn)報(bào)道澤漆主要含二祗醋類、黃酬、=祗、醬醇、 多酪類、氨基酸及天然油脂類化合物,二祗醋類、黃酬類化合物,是其主要的生物活性物質(zhì)。 主要分布于澤漆的乳汁中,根部也有分布。二祗醋類化合物對(duì)皮膚有刺激性,有輔助抗癌的 作用。澤漆中分離得到的黃酬類化合物主要包括搬皮素、山奈酪和W搬皮素為巧元的黃酬 巧,如搬皮素-3-e-葡萄糖巧,搬皮素-3-0-半乳糖巧(金絲桃巧)等(楊莉,陳海霞,高文遠(yuǎn). 澤漆化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥,2007,38(10): 1585-1589)。
[0004] 銀屑病俗稱"牛皮癖",是一種W皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖為病理特征,同時(shí)還 伴隨慢性炎癥的皮膚疾病,其發(fā)病機(jī)制至今仍不十分清楚。我國(guó)目前有650萬(wàn)左右的銀屑病 患者,患者多為青壯年,患者的皮膚表現(xiàn)為銀白色鱗屑的紅色斑塊,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì) 量。
[0005] 治療藥物主要分為:外用藥包括維生素化類似物,維A酸等乳膏劑;內(nèi)用藥包括甲 氨蝶嶺,糖皮質(zhì)激素,維A酸W及環(huán)抱素 A,他克莫司,霉芬酸醋等免疫抑制劑;物理療法包括 寬譜中波紫外線(BB-UVB)療法,窄譜中波紫外線(NB-UVB)療法等;中醫(yī)中藥治療包括復(fù)方 青黛丸、雷公藤、復(fù)方丹參片等中成藥。目前銀屑病還無(wú)特效治療藥,市場(chǎng)上的西藥制劑仍 W控制癥狀為主,且含有激素成份,用藥后給患者帶來(lái)副作用。
[0006] 澤漆藥材資源豐富,藥用歷史悠久。其生物活性多樣,具有較高的藥用價(jià)值。近年 來(lái)對(duì)澤漆進(jìn)行了多方面的開(kāi)發(fā)和利用,包括抗腫瘤、抗單純性瘤疹病毒和治療阻肺型哮喘 等。臨床上有將澤漆與大青葉,板藍(lán)根,±巧等,半枝蓮,龍膽草,黃琴,貫眾等十幾味中藥配 伍組成復(fù)方澤漆沖劑巧Ij濤峰,張虹亞,劉小平,等.復(fù)方澤漆沖劑治療進(jìn)行期尋常性銀屑病 的療效觀察及對(duì)血清TNF-a,比-8的影響.中國(guó)皮膚性病學(xué)志.2008,22(5): 281-283)或?qū)?漆加水煎煮并濃縮制成膠囊劑,注射劑(盛仲靈,顧乃芳,吳季莊,等.澤漆治療銀屑病的探 討.安徽醫(yī)學(xué),1980,44-47)用于銀屑病患者的治療,并且具有較好的療效。但是目前均采用 澤漆復(fù)方制劑治療銀屑病,將澤漆作為方劑中的某一味藥或制成粗提物,成分較多,質(zhì)量控 制較為復(fù)雜,為了解決現(xiàn)有技術(shù)中澤漆復(fù)方用藥,成分復(fù)雜的問(wèn)題,本發(fā)明提供了一種澤漆 提取物的有效部位,制備方法及其在抗銀屑病方面的應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的在于提供澤漆提取物,優(yōu)選提取方法,有效部位篩選、制備及其在抗 銀屑病方面的新用途。
[000引基于W上目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0009] 提取方法的優(yōu)選:
[0010] 首先采用不同的提取方法對(duì)澤漆藥材進(jìn)行提取,分別70%-95%乙醇溶液回流提 取,50 % -70 %乙醇水溶液回流提取,95 %乙醇溶液浸潰提取,95 %乙醇溶液超聲提取,水煎 煮,合并提取液,過(guò)濾,減壓蒸干溶劑,分別得到提取物E1,E2,E3,E4,E5。
[0011] 對(duì)上述不同提取方法所得的提取物61,62,63,64,65進(jìn)行體外抗銀屑病活性篩選:
[0012] TNF-a刺激人永生化表皮細(xì)胞(化化T)的增殖來(lái)模擬銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增 殖的基本病理特征,建立體外模型。
[OOU]澤漆的許多活性的研究均為粗提物,多為簡(jiǎn)單的水提物(張軍峰,馬肖兵,詹臻.澤 漆體外抗單純瘤疹病毒活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(19): 8134;蔡鷹,陸瑜,梁秉 文,等.澤漆根體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥材,1999,22 (2): 85-87;但水提取有一定的局 限性,因?yàn)樗疄閺?qiáng)極性溶劑,提取的主要成分一般為糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)酸 鹽等,對(duì)于一些極性較小的活性成分的提取率較低。而澤漆當(dāng)中的主要的生物活性物質(zhì)二 祗醋類顯然屬于極性較小的化學(xué)成分,水提對(duì)其提取率會(huì)大大降低。同時(shí)由于水提需要經(jīng) 過(guò)l〇〇°C的煎煮,溫度較高會(huì)破壞澤漆中某些化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)。而醇提或水醇提取提取率 高,能將植物中的大部分活性成分提取出來(lái)。
[0014] 體外抗銀屑病活性篩選結(jié)果顯示(表1),E1,E2對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞化化T的IC50分別 為212.化g/ml,206.化g/ml,較其他提取方法所得提取物活性好,為此我們考慮采用70 %~ 95 %的乙醇水溶液進(jìn)行提取。
[0015] 澤漆抗銀屑病有效部位的篩選:
[0016] 取適量澤漆藥材,90 %乙醇回流提取合并提取液,過(guò)濾,減壓蒸干溶劑得澤漆浸 膏。將浸膏加水分散,依次用石油酸、氯仿、乙酸乙醋、正下醇浸膏進(jìn)行萃取,合并萃取液,減 壓蒸干溶劑,即得澤漆的石油酸部位(Fra),氯仿部位(Frb),乙酸乙醋部位(FrC),正下醇部 位(Frd)。
[0017]對(duì)W上部位進(jìn)行體外抗銀屑病活性篩選:
[0018] 結(jié)果顯示(表2),澤漆的石油酸部位(Fra)和氯仿(Frb)部位對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞 化化T的IC50值分別為172.化g/ml,208.6iig/ml,較其他部位活性好。由此推測(cè)澤漆抗銀屑 病的有效部位可能為F巧和Frb。
[0019] 澤漆提取物抗銀屑病有效部位的制備:
[0020] 取澤漆藥材(1化g),倒入提取罐,力的0%的乙醇水溶液60~80L,回流提取2~4次, 每次18~2地,合并提取液,過(guò)濾。乙醇提取液減壓蒸饋回收乙醇后得澤漆總提物浸膏。
[0021] 澤漆總提物浸膏加水混懸后,依次用等體積石油酸、氯仿反復(fù)萃取2~4次,合并萃 取液,減壓蒸干溶劑得石油酸部位Fra(ISOg),該部位為黑色半固體制劑??杉尤胂鄳?yīng)的輔 料制成乳膏劑。氯仿部位Frb(210g),該部位為深棟色半固體制劑,亦可加入相應(yīng)的輔料制 成乳膏劑。
[0022] 為弄清澤漆抗銀屑病有效部位的化學(xué)成分,我們對(duì)有效部位進(jìn)行系統(tǒng)的分離。
[0023] 有效部位化學(xué)成分研究:
[0024] 石油酸部位Fra(120g)經(jīng)硅膠柱色譜梯度洗脫、中低壓柱色譜、MCI、0DS-C18柱、反 復(fù)硅膠柱色譜W及重結(jié)晶等方法進(jìn)一步分離和純化,得到化合物l(277mg),2(135mg),10 (55mg),ll(34mg),12(28mg),13(34mg),14(45mg),15(8mg),16/17(12mg)。
[0025] 氯仿部位Frb(250g)經(jīng)硅膠柱色譜梯度洗脫、中低壓柱色譜、MCI、0DS-C18柱、反復(fù) 硅膠柱色譜W及重結(jié)晶等方法進(jìn)一步分離和純化,得到化合物3(25mg),4(31mg),5(15mg), 6(23mg),7(15mg),S(IOmg),9(8mg)。
[00%]單體化合物結(jié)構(gòu)鑒定:
[0027] 通過(guò)波譜學(xué)技術(shù)(4-醒3,13(:-醒1?,^及20-醒1〇進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
[0028] 單體化合物鑒定為:正S十一燒醇(l)、e-谷醬醇(2)、金色酷胺醇脂(3)、搬皮素 (4)、5-徑基-6,7-二甲氧基黃酬(5)、山奈酪香豆酷基葡萄化喃糖巧(6)、抽皮素(7)、異嗦皮 晚(8)、松脂素(9)、14a,150-二乙酷氧基-3a,70-二苯甲酯基-9-氧代-20,13a-麻風(fēng)樹(shù)-5E, IlE-二締(10Keuphoscopin B(Il),大戟巧1(12),ingenol(13),大戟巧n (14)7a-徑基谷 醬醇(15) (24R/S)-環(huán)阿屯-25-締-30,24-二醇(16/17)。
[0029] 單體化合物對(duì)化化T增殖的影響:
[0030] 利用CCK-8法檢測(cè)分離得到的單體化合物對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞化化T增殖的影響,比較 各化合物的IC50值,W維A酸作為陽(yáng)性對(duì)照藥。
[0031] 結(jié)果顯示,除化合物2,3,6,10,15,16,17外,其余化合都對(duì)化化T細(xì)胞有一定的增 殖抑制的能力(表3)。其中化合物4,9,11的抑制作用接近陽(yáng)性藥維A酸(52.67皿ol/L)。
[0032] 銀屑病是慢性炎癥性皮膚疾病,炎癥在疾病的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。而銀屑 病患者的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞存在炎性因子(包括IL-I,化-6等)分泌異常的現(xiàn)象。為此我們 檢測(cè)了單體化合物TNF-a刺激的化化T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。
[0033] 單體化合物對(duì)TNF-a刺激的化化T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。
[0034] 采用Elisa法測(cè)定TNF-a刺激的化化T細(xì)胞上清中IL-I和化-6的含量,W化合物4搬 皮素作為陽(yáng)性對(duì)照藥。結(jié)果顯示,化合物對(duì)TNF-a刺激的化化T細(xì)胞IL-I分泌量差異無(wú)統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義(P〉〇.〇5),但能在一定程度上減少IL-6的分泌(P<0.05)(表4)。
[0035] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究表明:中藥澤漆70%-95%醇提取物,及其石油酸部位(Fra)和氯 仿部位(Frb)能較好的抑制皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖,同時(shí)該部位分離所得的單體化 合物在抑制角質(zhì)形成細(xì)胞及降低炎癥因子(比-6)方面都有良好效果。
[0036] 本發(fā)明提供了澤漆提取物抗銀屑病的新用途。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為不同提取方法提取澤漆的流程圖;
[0038] 圖2為澤漆總浸膏的萃取流程圖;
【具體實(shí)施方式】
[0039] 實(shí)施例1提取方法的優(yōu)選
[0040] 首先采用不同的提取方法對(duì)澤漆藥材進(jìn)行提取,取澤漆藥材5份,每份25g,分別用 95%乙醇回流提取2~3次,70%乙醇回流提取2~3次,95%乙醇浸潰提取2~3次,95%乙醇 超聲提取2~3次,水煎煮2~3次,合并提取液,過(guò)濾,減壓蒸干溶劑,分別得到提取物El,E2, E3,E4,E5。
[0041] 對(duì)上述不同提取方法所得的提取物61,62,63,64,65進(jìn)行體外抗銀屑病活性篩選:
[0042] 材料與試劑:
[0043] 澤漆提取物;胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司高糖培養(yǎng)基(美 國(guó)HyClone); CCK-8試劑盒(上海貝博生物)。
[0044] 體外模型的建立:
[0045] TNF-a刺激人永生化表皮細(xì)胞(化化T)的增殖來(lái)模擬銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增 殖的基本病理特征。
[0046] 操作方法:
[0047] 取對(duì)數(shù)期的化CaT細(xì)胞W4X IO3個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中,邊緣孔用PBS 填充,空白對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基不接種細(xì)胞,置于37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中解育化后, 加TNF-a (lOng/ml)刺激,置于37°C、5 % C〇2培養(yǎng)箱中解育2地。
[004引 CCK-騎去檢測(cè)61,62,63,64,65對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞化化1'的增殖抑制作用。
[0049] 方法:取對(duì)數(shù)期的化化T細(xì)胞W4X IO3個(gè)/孔的細(xì)胞