澤漆提取物及制備方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及中草藥提取物及其應(yīng)用，具體設(shè)及澤漆提取物的提取方法優(yōu)選，有效 部位篩選，提取物的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 澤漆巧uphorbia helioscopia L.)又名貓眼草、五朵云、五鳳草，為大戟目大戟科 一年生或兩年生草本植物，分布于除新疆、西藏W外的全國(guó)各省區(qū)，資源豐富。澤漆味辛、 苦，性微寒，全草入藥，主治水氣腫滿，疲飲喘咳追疾，菌頻，療痛，結(jié)核性擾管，骨髓炎。（江 蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上冊(cè).上海:上海人民出版社，1977:1464-1465)研究表明澤漆 具有抗腫瘤，抑菌殺蟲，止咳平喘等藥理作用(楊莉，陳海霞，高文遠(yuǎn).澤漆化學(xué)成分及其藥 理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2007,38(10): 1585-1589)。
[0003] 澤漆所含的化學(xué)成分種類較多，文獻(xiàn)報(bào)道澤漆主要含二祗醋類、黃酬、=祗、醬醇、 多酪類、氨基酸及天然油脂類化合物，二祗醋類、黃酬類化合物，是其主要的生物活性物質(zhì)。 主要分布于澤漆的乳汁中，根部也有分布。二祗醋類化合物對(duì)皮膚有刺激性，有輔助抗癌的 作用。澤漆中分離得到的黃酬類化合物主要包括搬皮素、山奈酪和W搬皮素為巧元的黃酬 巧，如搬皮素-3-e-葡萄糖巧，搬皮素-3-0-半乳糖巧(金絲桃巧)等(楊莉，陳海霞，高文遠(yuǎn). 澤漆化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2007,38(10): 1585-1589)。
[0004] 銀屑病俗稱"牛皮癖"，是一種W皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖為病理特征，同時(shí)還 伴隨慢性炎癥的皮膚疾病，其發(fā)病機(jī)制至今仍不十分清楚。我國(guó)目前有650萬(wàn)左右的銀屑病 患者，患者多為青壯年，患者的皮膚表現(xiàn)為銀白色鱗屑的紅色斑塊，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì) 量。
[0005] 治療藥物主要分為：外用藥包括維生素化類似物，維A酸等乳膏劑；內(nèi)用藥包括甲 氨蝶嶺，糖皮質(zhì)激素，維A酸W及環(huán)抱素 A，他克莫司，霉芬酸醋等免疫抑制劑;物理療法包括 寬譜中波紫外線(BB-UVB)療法，窄譜中波紫外線(NB-UVB)療法等；中醫(yī)中藥治療包括復(fù)方 青黛丸、雷公藤、復(fù)方丹參片等中成藥。目前銀屑病還無(wú)特效治療藥，市場(chǎng)上的西藥制劑仍 W控制癥狀為主，且含有激素成份，用藥后給患者帶來(lái)副作用。
[0006] 澤漆藥材資源豐富，藥用歷史悠久。其生物活性多樣，具有較高的藥用價(jià)值。近年 來(lái)對(duì)澤漆進(jìn)行了多方面的開(kāi)發(fā)和利用，包括抗腫瘤、抗單純性瘤疹病毒和治療阻肺型哮喘 等。臨床上有將澤漆與大青葉，板藍(lán)根，±巧等，半枝蓮，龍膽草，黃琴，貫眾等十幾味中藥配 伍組成復(fù)方澤漆沖劑巧Ij濤峰，張虹亞，劉小平，等.復(fù)方澤漆沖劑治療進(jìn)行期尋常性銀屑病 的療效觀察及對(duì)血清TNF-a，比-8的影響.中國(guó)皮膚性病學(xué)志.2008，22(5): 281-283)或?qū)?漆加水煎煮并濃縮制成膠囊劑，注射劑(盛仲靈，顧乃芳，吳季莊，等.澤漆治療銀屑病的探 討.安徽醫(yī)學(xué)，1980,44-47)用于銀屑病患者的治療，并且具有較好的療效。但是目前均采用 澤漆復(fù)方制劑治療銀屑病，將澤漆作為方劑中的某一味藥或制成粗提物，成分較多，質(zhì)量控 制較為復(fù)雜，為了解決現(xiàn)有技術(shù)中澤漆復(fù)方用藥，成分復(fù)雜的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種澤漆 提取物的有效部位，制備方法及其在抗銀屑病方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供澤漆提取物，優(yōu)選提取方法，有效部位篩選、制備及其在抗 銀屑病方面的新用途。
[000引基于W上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 提取方法的優(yōu)選：
[0010] 首先采用不同的提取方法對(duì)澤漆藥材進(jìn)行提取，分別70%-95%乙醇溶液回流提 取，50 % -70 %乙醇水溶液回流提取，95 %乙醇溶液浸潰提取，95 %乙醇溶液超聲提取，水煎 煮，合并提取液，過(guò)濾，減壓蒸干溶劑，分別得到提取物E1，E2，E3，E4，E5。
[0011] 對(duì)上述不同提取方法所得的提取物61，62,63,64,65進(jìn)行體外抗銀屑病活性篩選：
[0012] TNF-a刺激人永生化表皮細(xì)胞(化化T)的增殖來(lái)模擬銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增 殖的基本病理特征，建立體外模型。
[OOU]澤漆的許多活性的研究均為粗提物，多為簡(jiǎn)單的水提物(張軍峰，馬肖兵，詹臻.澤 漆體外抗單純瘤疹病毒活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(19): 8134;蔡鷹，陸瑜，梁秉 文，等.澤漆根體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥材，1999，22 (2): 85-87;但水提取有一定的局 限性，因?yàn)樗疄閺?qiáng)極性溶劑，提取的主要成分一般為糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)酸 鹽等，對(duì)于一些極性較小的活性成分的提取率較低。而澤漆當(dāng)中的主要的生物活性物質(zhì)二 祗醋類顯然屬于極性較小的化學(xué)成分，水提對(duì)其提取率會(huì)大大降低。同時(shí)由于水提需要經(jīng) 過(guò)l〇〇°C的煎煮，溫度較高會(huì)破壞澤漆中某些化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)。而醇提或水醇提取提取率 高，能將植物中的大部分活性成分提取出來(lái)。
[0014] 體外抗銀屑病活性篩選結(jié)果顯示(表1)，E1，E2對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞化化T的IC50分別 為212.化g/ml，206.化g/ml，較其他提取方法所得提取物活性好，為此我們考慮采用70 %~ 95 %的乙醇水溶液進(jìn)行提取。
[0015] 澤漆抗銀屑病有效部位的篩選：
[0016] 取適量澤漆藥材，90 %乙醇回流提取合并提取液，過(guò)濾，減壓蒸干溶劑得澤漆浸 膏。將浸膏加水分散，依次用石油酸、氯仿、乙酸乙醋、正下醇浸膏進(jìn)行萃取，合并萃取液，減 壓蒸干溶劑，即得澤漆的石油酸部位(Fra),氯仿部位(Frb),乙酸乙醋部位(FrC),正下醇部 位(Frd)。
[0017]對(duì)W上部位進(jìn)行體外抗銀屑病活性篩選：
[0018] 結(jié)果顯示（表2)，澤漆的石油酸部位(Fra)和氯仿(Frb)部位對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞 化化T的IC50值分別為172.化g/ml，208.6iig/ml，較其他部位活性好。由此推測(cè)澤漆抗銀屑 病的有效部位可能為F巧和Frb。
[0019] 澤漆提取物抗銀屑病有效部位的制備：
[0020] 取澤漆藥材（1化g)，倒入提取罐，力的0%的乙醇水溶液60~80L，回流提取2~4次， 每次18~2地，合并提取液，過(guò)濾。乙醇提取液減壓蒸饋回收乙醇后得澤漆總提物浸膏。
[0021] 澤漆總提物浸膏加水混懸后，依次用等體積石油酸、氯仿反復(fù)萃取2~4次，合并萃 取液，減壓蒸干溶劑得石油酸部位Fra(ISOg)，該部位為黑色半固體制劑?？杉尤胂鄳?yīng)的輔 料制成乳膏劑。氯仿部位Frb(210g)，該部位為深棟色半固體制劑，亦可加入相應(yīng)的輔料制 成乳膏劑。
[0022] 為弄清澤漆抗銀屑病有效部位的化學(xué)成分，我們對(duì)有效部位進(jìn)行系統(tǒng)的分離。
[0023] 有效部位化學(xué)成分研究：
[0024] 石油酸部位Fra(120g)經(jīng)硅膠柱色譜梯度洗脫、中低壓柱色譜、MCI、0DS-C18柱、反 復(fù)硅膠柱色譜W及重結(jié)晶等方法進(jìn)一步分離和純化，得到化合物l(277mg)，2(135mg)，10 (55mg)，ll(34mg)，12(28mg)，13(34mg)，14(45mg)，15(8mg)，16/17(12mg)。
[0025] 氯仿部位Frb(250g)經(jīng)硅膠柱色譜梯度洗脫、中低壓柱色譜、MCI、0DS-C18柱、反復(fù) 硅膠柱色譜W及重結(jié)晶等方法進(jìn)一步分離和純化，得到化合物3(25mg)，4(31mg)，5(15mg)， 6(23mg)，7(15mg)，S(IOmg)，9(8mg)。
[00%]單體化合物結(jié)構(gòu)鑒定：
[0027] 通過(guò)波譜學(xué)技術(shù)(4-醒3，13(：-醒1?，^及20-醒1〇進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
[0028] 單體化合物鑒定為：正S十一燒醇（l)、e-谷醬醇（2)、金色酷胺醇脂（3)、搬皮素 (4)、5-徑基-6,7-二甲氧基黃酬(5)、山奈酪香豆酷基葡萄化喃糖巧(6)、抽皮素(7)、異嗦皮 晚(8)、松脂素(9)、14a，150-二乙酷氧基-3a，70-二苯甲酯基-9-氧代-20，13a-麻風(fēng)樹(shù)-5E， IlE-二締（10Keuphoscopin B(Il)，大戟巧1(12)，ingenol(13)，大戟巧n (14)7a-徑基谷 醬醇（15) (24R/S)-環(huán)阿屯-25-締-30，24-二醇（16/17)。
[0029] 單體化合物對(duì)化化T增殖的影響：
[0030] 利用CCK-8法檢測(cè)分離得到的單體化合物對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞化化T增殖的影響，比較 各化合物的IC50值，W維A酸作為陽(yáng)性對(duì)照藥。
[0031] 結(jié)果顯示，除化合物2，3，6,10,15,16,17外，其余化合都對(duì)化化T細(xì)胞有一定的增 殖抑制的能力(表3)。其中化合物4，9，11的抑制作用接近陽(yáng)性藥維A酸(52.67皿ol/L)。
[0032] 銀屑病是慢性炎癥性皮膚疾病，炎癥在疾病的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。而銀屑 病患者的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞存在炎性因子(包括IL-I，化-6等）分泌異常的現(xiàn)象。為此我們 檢測(cè)了單體化合物TNF-a刺激的化化T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。
[0033] 單體化合物對(duì)TNF-a刺激的化化T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。
[0034] 采用Elisa法測(cè)定TNF-a刺激的化化T細(xì)胞上清中IL-I和化-6的含量，W化合物4搬 皮素作為陽(yáng)性對(duì)照藥。結(jié)果顯示，化合物對(duì)TNF-a刺激的化化T細(xì)胞IL-I分泌量差異無(wú)統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義(P〉〇.〇5)，但能在一定程度上減少IL-6的分泌(P<0.05)(表4)。
[0035] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究表明：中藥澤漆70%-95%醇提取物，及其石油酸部位(Fra)和氯 仿部位(Frb)能較好的抑制皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖，同時(shí)該部位分離所得的單體化 合物在抑制角質(zhì)形成細(xì)胞及降低炎癥因子(比-6)方面都有良好效果。
[0036] 本發(fā)明提供了澤漆提取物抗銀屑病的新用途。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為不同提取方法提取澤漆的流程圖；
[0038] 圖2為澤漆總浸膏的萃取流程圖；
【具體實(shí)施方式】
[0039] 實(shí)施例1提取方法的優(yōu)選
[0040] 首先采用不同的提取方法對(duì)澤漆藥材進(jìn)行提取，取澤漆藥材5份，每份25g，分別用 95%乙醇回流提取2~3次，70%乙醇回流提取2~3次，95%乙醇浸潰提取2~3次，95%乙醇 超聲提取2~3次，水煎煮2~3次，合并提取液，過(guò)濾，減壓蒸干溶劑，分別得到提取物El，E2， E3，E4，E5。
[0041] 對(duì)上述不同提取方法所得的提取物61，62,63,64,65進(jìn)行體外抗銀屑病活性篩選：
[0042] 材料與試劑：
[0043] 澤漆提取物;胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司高糖培養(yǎng)基(美 國(guó)HyClone); CCK-8試劑盒(上海貝博生物）。
[0044] 體外模型的建立：
[0045] TNF-a刺激人永生化表皮細(xì)胞(化化T)的增殖來(lái)模擬銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增 殖的基本病理特征。
[0046] 操作方法：
[0047] 取對(duì)數(shù)期的化CaT細(xì)胞W4X IO3個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，邊緣孔用PBS 填充，空白對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基不接種細(xì)胞，置于37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中解育化后， 加TNF-a (lOng/ml)刺激，置于37°C、5 % C〇2培養(yǎng)箱中解育2地。
[004引 CCK-騎去檢測(cè)61，62,63,64,65對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞化化1'的增殖抑制作用。
[0049] 方法:取對(duì)數(shù)期的化化T細(xì)胞W4X IO3個(gè)/孔的細(xì)胞