去甲萬(wàn)古霉素衍生物及其制備純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明設(shè)及去甲萬(wàn)古霉素衍生物及其制備 純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 去甲萬(wàn)古霉素是一類(lèi)糖膚類(lèi)抗生素，在中國(guó)已經(jīng)商業(yè)化應(yīng)用近四十年，臨床主要 應(yīng)用于治療屯、內(nèi)膜炎、骨髓炎等嚴(yán)重感染性疾病。去甲萬(wàn)古霉素主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效， 特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐青霉素的腸桿菌、肺炎 鏈球菌W及梭狀芽抱桿菌。去甲萬(wàn)古霉素的產(chǎn)生菌為1959年李群等從貴州±壤中分離出的 放線菌萬(wàn)-23號(hào)，后來(lái)命名為東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)。去甲萬(wàn)古霉素 有著與另一個(gè)糖膚類(lèi)化合物萬(wàn)古霉素(VCM)基本類(lèi)似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，它們均由一 個(gè)Ξ環(huán)組成的屯膚母體和一個(gè)由葡萄糖-氨基糖組成的雙糖取代基，不同之處在于去甲萬(wàn) 古霉素的N-末端較萬(wàn)古霉素缺少一個(gè)N-甲基（圖1)。文獻(xiàn)中組成屯膚的氨基酸分別WAA-1 到AA-7表示，五個(gè)芳香環(huán)從A-E依次編號(hào)，另外，Ξ個(gè)大環(huán)的編號(hào)W芳香環(huán)編號(hào)組成A-B，C- 0-D和D-0-E，為了方便化合物結(jié)構(gòu)解析，本申請(qǐng)將沿用文獻(xiàn)的編號(hào)方法。
[0003] 早期，萬(wàn)古霉素初始使用階段，臨床使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其引起多種負(fù)反應(yīng)，如腎毒性 和耳毒性等，可能的原因是其純度低，雜質(zhì)含量高的原因。隨后，人們使用高效液相色譜 化PLC)，毛細(xì)管電泳(CE似及液相質(zhì)譜-質(zhì)譜連用技術(shù)(LC-MS/MS)對(duì)萬(wàn)古霉素有關(guān)物質(zhì)進(jìn) 行過(guò)系統(tǒng)深入的研究，從中發(fā)現(xiàn)了八個(gè)雜質(zhì)分別是去氯萬(wàn)古霉素 A和B，去雙氯萬(wàn)古霉素，萬(wàn) 古霉素過(guò)程降解產(chǎn)物CDP-Im和CDP-Im，去雙糖萬(wàn)古霉素，去氨基糖萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉 素。進(jìn)一步藥理活性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，含有CDP-Im和CDP-Im的萬(wàn)古霉素藥品能引起臨床治療失 敗，而Ξ個(gè)去氯萬(wàn)古霉素類(lèi)似物的抗菌活性比萬(wàn)古霉素降低了 2至10倍，去氨基糖的萬(wàn)古霉 素的體內(nèi)抗菌活性也大大降低，MIC約為萬(wàn)古霉素的五倍。因此，《歐洲藥典》和《美國(guó)藥典》 將去氨基-，去雙糖基-，和去甲基萬(wàn)古霉素定義為萬(wàn)古霉素原料Ξ個(gè)主要雜質(zhì)，并且規(guī)定其 單雜不得超過(guò)4%，總雜不得超過(guò)7%。
[0004] 相比而言，去甲萬(wàn)古霉素由于其雜質(zhì)成分不明確，因此，中國(guó)藥典規(guī)定W峰面積積 分計(jì)算，總雜不得超過(guò)12%，單雜少于4%。因此，需要更為有效的純化及鑒定去甲萬(wàn)古霉素 的方法，同時(shí)，為了明確去甲萬(wàn)古霉素原料藥中有關(guān)物質(zhì)成分結(jié)構(gòu)，還可W對(duì)去甲萬(wàn)古霉素 原料藥進(jìn)行更為系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，發(fā)掘其新結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明從去甲萬(wàn)古霉素原料藥中分離得到Ξ個(gè)糖膚類(lèi)化合物，借助于1D，2D NMR 和HRESIMS等方法確定Ξ個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，均為去甲萬(wàn)古霉素類(lèi)似物，包括一個(gè)C-0-D開(kāi)環(huán)和 兩個(gè)去糖基衍生物。
[0006]本發(fā)明首先設(shè)及一種去甲萬(wàn)古霉素及其衍生物的HPLC制備分離方法，所述方法 為：
[0007] (1)流動(dòng)相：甲醇:0.05~0.2 %甲酸水溶液，
[000引（2)梯度洗脫步驟:30~50min內(nèi)甲醇從10%逐漸上升至70%，
[0009] (3)將去甲萬(wàn)古霉素原料藥水溶液過(guò)色譜柱，流速為1.0~5.Oml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 280nm，所述的去甲萬(wàn)古霉素原料藥優(yōu)選為去甲萬(wàn)古霉素鹽酸鹽原料藥，
[0010] (4)收集主峰產(chǎn)物即得去甲萬(wàn)古霉素純品，收集次峰產(chǎn)物即得去甲萬(wàn)古霉素衍生 物。
[0011] 所述方法中，色譜柱優(yōu)選為C18色譜柱或苯基柱。
[0012] 本發(fā)明還設(shè)及由所述方法分離獲得的去甲萬(wàn)古霉素衍生物，所述的去甲萬(wàn)古霉素 衍生物為:化合物1(結(jié)構(gòu)如下式1所示）、化合物2或3(結(jié)構(gòu)如下式2、3所示），
[0013]
[0014] R = 0-D-glucosyl，式2;
[0015] R = H，式 3
[0016] 本發(fā)明還設(shè)及所述化合物1-3在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物為抗革蘭氏陽(yáng)性菌 的藥物，所述的革蘭氏陽(yáng)性菌優(yōu)選為:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球 菌、耐青霉素的腸桿菌、肺炎鏈球菌W及梭狀芽抱桿菌。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1化合物1-3,去甲萬(wàn)古霉素和萬(wàn)古霉素的結(jié)構(gòu)，化合物1的HMBC相關(guān)用虛線彎箭 頭表不。
[0018] 圖2去甲萬(wàn)古霉素原料藥的HPLC色譜分析圖。
[0019] 2A，使用《中國(guó)藥典》方法的冊(cè)L姻譜；
[0020] 2B，A圖中a，b，c和去甲萬(wàn)古霉素的紫外圖譜疊加圖；
[0021 ] 2C，方法優(yōu)化后HPLC圖譜；
[0022] 2D，C圖中雜質(zhì)1，2,3,4和去甲萬(wàn)古霉素的紫外圖譜疊加圖。
[0023] 圖3去甲萬(wàn)古霉素(母離子為[M+扣Vz 1434,圖3A)和化合物1(母離子為[M+扣V Z1452，圖3C)的ESIMS/MS圖和兩者的裂解途徑(3B為去甲萬(wàn)古霉素，3D為化合物1)。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 去甲萬(wàn)古霉素鹽酸鹽由華北制藥（中國(guó)河北石家莊市)提供；
[0025] 萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；
[0026] 色譜級(jí)乙臘和甲醇購(gòu)于Adamas公司（中國(guó)上海）；
[0027] DMSO-ds由Cambridge Isotope公司生產(chǎn)（Cambridge ,ΜΑ,USA.);
[0028] 所有其它試劑（甲酸、憐酸、鹽酸、Ξ氣乙酸、氨水(含氨氣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25~28%)、 Ξ乙胺、四氨巧喃)均為化學(xué)級(jí)。
[0029] 使用的儀器，包括Ρ-2000旋光儀(JASC0，Tokyo Japan)，JASC0P-650紫外分光光度 計(jì)（JASC0)，SYS 600MHz核磁儀（Palo Alto,CA,USA)，F(xiàn)innigan LTQ XT離子阱質(zhì)譜儀 (Finnigan,San Jose,CA)，F(xiàn)innigan LTQ軌道離子阱譜儀(Finnigan)，島津LC-20液相色譜 儀（Shim曰dzu,Jap曰η)D
[0030] 核磁測(cè)定方法：
[0031] 所有樣品的1h和1化NMR均在帶低溫探頭的SYS 600MHz核磁儀上測(cè)定，溶劑為気代 DMS0。1h和 1? NMR化學(xué)位移均使用TMS(δ = 0.0 Oppm)和DMSO-ds(δ = 39.5ppm)溶劑做內(nèi)標(biāo)。
[0032] 實(shí)施例1化合物1~3的制備與分離純化
[0033] 首先，我們使用了《中國(guó)藥典》中去甲萬(wàn)古霉素原料藥HPLC方法來(lái)分析樣品（見(jiàn)圖 2A和2B)，發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間為21.44min的一個(gè)主峰，積分面積占所有峰面積總和的95.5%， 根據(jù)藥典中去甲萬(wàn)古霉素出峰位置為18~22min，推測(cè)該物質(zhì)就是去甲萬(wàn)古霉素，另外，如 圖2A中所示，保留時(shí)間在該主峰前后還存在至少Ξ個(gè)積分面積較小的雜質(zhì)峰，保留時(shí)間分 別為10.31(a) ,12.30(b) ,14.73(c)min，它們的在線紫外吸收峰型也與去甲萬(wàn)古霉素相類(lèi) 似，如圖2B所示。然而，由于該方法中使用了憐酸鹽，并且因?yàn)橹苽溥^(guò)程或者制備后樣品中 憐酸鹽的殘留會(huì)嚴(yán)重干擾質(zhì)譜檢測(cè)，因此，運(yùn)方法不適合對(duì)樣品進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (LC-MS)。
[0034] 我們?yōu)榱私柚贚C-MS初步獲得運(yùn)些衍生物雜質(zhì)分子量等相應(yīng)信息，建立了一套 流動(dòng)相不含鹽的HPLC方法。當(dāng)我們使用甲醇-0.1 %甲酸水溶液進(jìn)行HPLC分析時(shí)候，發(fā)現(xiàn)相 應(yīng)的主峰和雜質(zhì)峰都能獲得很好的峰型，并且雜質(zhì)與雜質(zhì)之間，雜質(zhì)與主峰之間也具有較 好的分離度，如圖2C所示，衍生物雜質(zhì)1，2，3，4峰面積分別占總面積的3.4 %，1.91 %， 0.96%，和 2.02%，主峰為87.97%。
[00對(duì) （1)優(yōu)化的HPLC分析方法如下：
[0036] Agilent。8色譜柱（150X4.6mm i.d. ,5皿），
[0037] 流動(dòng)相：甲醇:0.1 %甲酸水溶液，
[003引梯度洗脫步驟：（1)40111111內(nèi)甲醇從10%逐漸上升至70%。
[0039] 1.0ml mirfi流速，280皿波長(zhǎng)檢巧U，柱溫和檢測(cè)池溫度均為室溫(25°C)，3.Omg ml ^去甲萬(wàn)古霉素原料藥水溶液，進(jìn)樣量為20μ1。
[0040] (2)優(yōu)化的HPLC制備方法如下：
[0041 ] YMC-化ck苯基柱（150X20mm i.d.，20ym，YMC Co.，1^(1，的〇扣，化9日11)，流動(dòng)相配 置與梯度洗脫方法與分析實(shí)驗(yàn)一致。
[0042] 流速為5.0ml min-i，單次洗脫時(shí)間為120min。
[0043] lOO