使用具有3’發(fā)夾結(jié)構(gòu)的水解探針檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的制作方法
【專利說明】使用具有3 '發(fā)夾結(jié)構(gòu)的水解探針檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的診斷領(lǐng)域，而更具體地講，涉及使用水解 探針的PCR檢測(cè)方法。
[0002] 發(fā)明背景 PCR是復(fù)制或'擴(kuò)增'DNA或RNA小區(qū)段的高效率并且成本節(jié)約的方式。使用PCR，僅在幾 小時(shí)內(nèi)就可制造出數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的DNA部分的拷貝，得到分析所需的足夠的DNA。此方法使得 臨床醫(yī)生可以使用最小量的樣品（如血液或組織)來(lái)診斷和監(jiān)測(cè)疾病。實(shí)時(shí)PCR使得擴(kuò)增和 檢測(cè)可以同時(shí)進(jìn)行。一種檢測(cè)方法是通過使用寡核苷酸水解探針(也稱為TaqMan ?探針)完 成的，所述探針具有共價(jià)連接到例如該寡核苷酸探針5'端的熒光團(tuán)和例如內(nèi)部或3'端連接 的猝滅劑。水解探針是雙重標(biāo)記的寡核苷酸探針，其依靠 Taq聚合酶的5 '至3 '核酸外切酶 活性，在與互補(bǔ)靶序列雜交的過程中切割水解探針，并得到基于熒光的檢測(cè)。
[0003] 實(shí)時(shí)PCR方法可被用于在具有單核苷酸多態(tài)性(SNP)的靶核酸中擴(kuò)增和檢測(cè)序列 變異。然而，許多現(xiàn)有的SNP檢測(cè)/基因分型測(cè)定是基于SNP為雙等位基因的假設(shè)（參見，例 如，Morita 等人，Mol .Cel. Probes, 2007，21，171-176)。用現(xiàn)有的實(shí)時(shí) PCR 方法檢測(cè) SNP 缺乏足夠的靈敏度和特異性。水解探針(如標(biāo)準(zhǔn)TaqMan ?探針)通常被設(shè)計(jì)成長(zhǎng)約18至22 個(gè)堿基從而具有比引物高8-10°C的解鏈溫度(Tm)。標(biāo)準(zhǔn)TaqMan ?探針一般經(jīng)證明對(duì)于SNP 檢測(cè)的特異性不高并且不太靈敏，而且不能夠徹底區(qū)分WT(野生型)和MT(突變型)靶標(biāo)。現(xiàn) 有的基于TaqMan?的SNP基因分型測(cè)定涉及使用TaqMan ? MGB(小溝結(jié)合劑，Minor Groove Binder)探針，該探針在長(zhǎng)度上更短并且對(duì)于等位基因的區(qū)分具有增加的探針-模板結(jié)合穩(wěn) 定性。額外的堿基修飾如穩(wěn)定堿基(丙炔基dU、丙炔基dC)也可被包括在標(biāo)準(zhǔn)TaqMan ?探針 設(shè)計(jì)中用于改進(jìn)的SNP檢測(cè)和區(qū)分。因此，在本領(lǐng)域中需要一種以靈敏的方式特異性檢測(cè) SNP的快速而可靠的方法。
[0004] 發(fā)明概述 本公開的主題包括SNP特異性水解探針，其被設(shè)計(jì)成包含偏向3'端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。此類水 解探針并不一定涉及使用額外的堿基修飾(如丙炔基dU、丙炔基dC)或特定分子(如MGB)?？?近探針的3'端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)會(huì)延緩探針的3'部分與模板的雜交，并因而有助于根據(jù)報(bào)告基因 與靠近5 '端的猝滅劑之間的單個(gè)錯(cuò)配來(lái)區(qū)分WT和MT靶標(biāo)。相比WT模板，SNP特異性探針的5 ' 部分可以更有效率地雜交至MT模板。當(dāng)SNP特異性探針發(fā)現(xiàn)WT靶標(biāo)時(shí)，與WT靶標(biāo)的單個(gè)錯(cuò)配 可以防止雜交和探針切割，并因而不會(huì)檢測(cè)到熒光。
[0005] 在一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)樣品中靶核酸的SNP的方法，該方法包括:進(jìn)行擴(kuò)增 步驟，包括使樣品與包含第一核酸序列的引物接觸，從而當(dāng)樣品中存在任何靶核酸時(shí)，產(chǎn)生 擴(kuò)增產(chǎn)物;進(jìn)行雜交步驟，包括使擴(kuò)增產(chǎn)物與包含第二核酸序列的SNP特異性水解探針接 觸，所述第二核酸序列與擴(kuò)增產(chǎn)物的含有SNP的區(qū)域互補(bǔ)，所述SNP特異性水解探針包含第 一和第二可相互作用的標(biāo)記、5'端和3'端以及偏向3'端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含含 有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的（例如，改變的或額外的）核苷酸的非天然存在的核酸序列區(qū)域 以產(chǎn)生所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)；以及檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物存在與否，其中存在擴(kuò)增產(chǎn)物表明在靶核酸靶標(biāo) 中存在SNP，而其中不存在擴(kuò)增產(chǎn)物表明在靶核酸靶標(biāo)中不存在SNP。在一個(gè)實(shí)施方案中，第 一可相互作用的標(biāo)記包含處于5'末端的供體熒光部分，并且第二可相互作用的標(biāo)記包含在 水解探針上所述供體熒光部分的不超過5個(gè)核苷酸之內(nèi)的對(duì)應(yīng)的受體熒光部分。在某些實(shí) 施方案中，受體熒光部分為猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增采用具有5'至3'核酸外切酶 活性的聚合酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，引物的第一核酸序列和/或水解探針的第二核酸序列 包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，引物的第一核酸序列和/或水解探 針的第二核酸序列具有40個(gè)或更少的核苷酸。
[0006] 在另一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)樣品中靶核酸的SNP的試劑盒，其包含:至少一種 引物，其包含特異性產(chǎn)生所述靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的第一核酸序列；和SNP特異性水解探針， 其包含與擴(kuò)增產(chǎn)物的含有SNP的區(qū)域互補(bǔ)的第二核酸序列，所述SNP特異性水解探針包含第 一和第二可相互作用的標(biāo)記、5'端和3'端以及偏向3'端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含含 有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的（例如，改變的或額外的）核苷酸的非天然存在的核酸序列區(qū)域 以產(chǎn)生所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一可相互作用的標(biāo)記包含處于5'末端的供體 熒光部分，并且第二可相互作用的標(biāo)記包含在水解探針上所述供體熒光部分的不超過5個(gè) 核苷酸之內(nèi)的對(duì)應(yīng)的受體熒光部分。在某些實(shí)施方案中，受體熒光部分為猝滅劑。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，試劑盒還包含具有5'至3'核酸外切酶活性的聚合酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，弓丨 物的第一核酸序列和/或水解探針的第二核酸序列包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸。在又另 一個(gè)實(shí)施方案中，引物的第一核酸序列和/或水解探針的第二核酸序列具有40個(gè)或更少的 核苷酸。
[0007] 在一個(gè)方面，提供了 SNP特異性水解探針，其包含與擴(kuò)增產(chǎn)物的含有SNP的區(qū)域互 補(bǔ)的核酸序列，所述SNP特異性水解探針包含第一和第二可相互作用的標(biāo)記、5'端和3'端以 及偏向3'端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含含有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的（例如，改變的或 額外的）核苷酸的非天然存在的核酸序列區(qū)域以產(chǎn)生所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第 一可相互作用的標(biāo)記可以是偏向、靠近或處于5'末端的供體熒光部分，并且第二可相互作 用的標(biāo)記可以是在水解探針上所述供體熒光部分的不超過5個(gè)核苷酸之內(nèi)的對(duì)應(yīng)的受體熒 光部分。在某些實(shí)施方案中，受體熒光部分為猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水解探針的核 酸序列包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，水解探針具有40個(gè)或更少 的核苷酸。
[0008] 除非另行定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普 通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管與本文所述那些類似或等同的方法和材料可用 于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，但仍然在下文中描述了合適的方法和材料。另外，所述材料、方法和 實(shí)施例僅為說明性的而非旨在限制。
[0009] 在以下的附圖和說明書中描述了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)內(nèi)容。從附 圖和詳細(xì)描述以及從權(quán)利要求書中，本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)是顯而易見的。 [00 10] 附圖簡(jiǎn)述 圖1示出了使用具有偏向3 '端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的水解探針檢測(cè)526N SNP的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲 線。
[0011]圖2示出了在MT質(zhì)粒（SEQ ID N0:5)和WT質(zhì)粒（SEQ ID N0:6)的一部分上526N SNP (CAC/AAC)的位置以及沒有發(fā)夾的探針(長(zhǎng)箭頭），該探針具有末端堿基替換以防止分子間 相互作用。
[0012] 圖3示出了用于526N SNP位置的水解探針的序列（SEQ ID N0:1)，所述探針被設(shè)計(jì) 成具有處于3'端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)并且有三個(gè)堿基被替換以形成該發(fā)夾。
[0013]圖4示出了使用沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的水解探針檢測(cè)526N SNP的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線。
[0014]圖5示出了使用具有偏向3'端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的水解探針檢測(cè)531L SNP的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò) 增曲線。
[0015] 圖6示出了在MT質(zhì)粒（SEQ ID N0:7)和WT質(zhì)粒（SEQ ID N0:8)的一部分上531L SNP (TCG/TTG)的位置以及沒有發(fā)夾的探針(長(zhǎng)箭頭）。
[0016] 圖7示出了用于531L SNP位置的水解探針的序列（SEQ ID N0:3)，所述探針被設(shè)計(jì) 成具有處于3'端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)并且有一個(gè)堿基被替換以形成該發(fā)夾。
[0017] 圖8示出了使用沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的水解探針檢測(cè)531L SNP的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線。
[0018] 發(fā)明詳述 本文描述了用于檢測(cè)樣品中靶核酸的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法、試劑盒和水解探 針。用于檢測(cè)靶核酸的SNP的實(shí)時(shí)PCR相比其它方法在靈敏度上的提升，以及實(shí)時(shí)PCR的改進(jìn) 特征(包括樣品容量(sample containment)和對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)），使得將這項(xiàng)技術(shù)實(shí) 施用于在臨床實(shí)驗(yàn)室中對(duì)靶核酸的SNP的常規(guī)診斷和檢測(cè)變得可行。
[0019] 方法可包括進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)步驟，該循環(huán)步驟包括在樣品中使用一種或多種引 物或一種或多種引物對(duì)，擴(kuò)增靶核酸分子的一個(gè)或多個(gè)部分，例如，含有待檢測(cè)的所關(guān)注的 SNP的基因革巴標(biāo)。如本文中所用，"引物"（"primer"、"primers"）和"引物對(duì)"指代寡核苷酸引 物，其特異性退火至核