用于分離基質(zhì)血管組分的方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年7月10日提交的新加坡專利申請?zhí)?013053095的優(yōu)先權(quán)的權(quán) 益，該新加坡專利申請的內(nèi)容出于所有目的在此W引用方式整體并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明設(shè)及用于細胞分離中的設(shè)備。
【背景技術(shù)】
[0004] 干細胞是用于開發(fā)再生療法的理想資源。通常，存在于人體中的干細胞數(shù)目有限， 并且完全優(yōu)化其純化和使用效率的方案仍在開發(fā)之中。脂肪組織已經(jīng)日益被視為是對再生 醫(yī)學(xué)潛在有益的干細胞的有前景的來源。除了成熟的脂肪細胞外，脂肪組織在基質(zhì)血管組 分（SVF)中還含有相對豐富的祖細胞和間充質(zhì)干細胞(MSC)群體(參見圖1)。據(jù)估計，多達 1 %的基質(zhì)血管組分細胞是間充質(zhì)干細胞，其在本公開中也被稱為脂肪來源的干細胞 (ASC)。運與在骨髓中僅占0.001-00.2%的間充質(zhì)干細胞不同，骨髓被認為是成體干細胞的 標準中屯、（化日361·等人，2006)。
[0005] 考慮到新加坡和全世界肥胖癥的上升，脂肪組織充當了可充足獲取且相對容易獲 得的獨特的干細胞儲庫。脂肪抽吸術(shù)(一種去除過多脂肪組織的操作)是在發(fā)達國家進行的 最常見的整形外科手術(shù)之一。例如，已知2012年在美國有超過313,000例脂肪抽吸手術(shù)。另 夕h與需要W高密度(超過50,000個細胞/cm 2)進行初始平板接種的骨髓來源的間充質(zhì)干細 胞不同，脂肪來源的干細胞可W低到3,000個細胞/cm2的密度接種，用于后續(xù)的培養(yǎng)生長 (Sotiropoulou，P.A.等人，2006)。脂肪來源的干細胞和骨髓來源的間充質(zhì)干細胞是增殖性 的和多能的，具有分化成有限的細胞類型如脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞和肌細胞的能力。 另外，脂肪來源的干細胞被顯示分化成將可用于組織和細胞替代療法的膜內(nèi)分泌細胞、神 經(jīng)元、上皮和內(nèi)皮(Cawthorn 等人，2012;Gimble 等人，2007W 及 0ng，W.K.和 S.Sugii，2013)。 由于脂肪來源的干細胞固有地分泌免疫調(diào)節(jié)因子、血管生成因子、抗細胞調(diào)亡因子和造血 因子，因此它們還可潛在地用于組織和創(chuàng)面修復(fù)。當前全世界使用基質(zhì)血管組分細胞或脂 肪來源的干細胞在各種各樣的疾病領(lǐng)域中正在進行超過80個臨床試驗化im等人，2014)。
[0006] 還證實脂肪來源的干細胞也可被理想地"再程序化"為誘導(dǎo)型多能干（iPS)細胞 (Sugii，S.等人，2011;Sugii，S.等人，2010)。脂肪來源的干細胞的再程序化效率大大高于 對于人成纖維細胞所報道的那些（高達100倍）并且可進行所述過程而無需動物飼養(yǎng)細胞 (W02011/032025A2)。通過建立生成來源于脂肪來源的干細胞的巧S細胞的無飼養(yǎng)細胞的、 無異源物的方案，運開辟了脂肪組織的應(yīng)用的甚至更寬的可能性，尤其是在iPS細胞如胚胎 干細胞在理論上能夠成為人或動物體的任何細胞類型時。
[0007] 盡管脂肪來源的干細胞有用于細胞替代和再生療法的潛力，但加工和開發(fā)脂肪組 織來源的產(chǎn)品的技術(shù)仍處于早期階段。典型的脂肪來源的干細胞分離方案設(shè)及通過膠原酶 消化分離的脂肪組織，之后離屯、W分開上浮的脂肪細胞和沉淀物組分中的含有脂肪來源的 干細胞的基質(zhì)血管組分化im等人，2014)。幾家公司也已開發(fā)加工脂肪組織和分離基質(zhì)血管 組分的半自動化裝置，所述裝置設(shè)及具有一次性用品的封閉系統(tǒng)，其將通過脂肪抽吸收獲 的脂肪組織消化成細胞，分離它們并將它們濃縮成用于立即遞送到患者中的懸液化im等 人，2014)。當前，本領(lǐng)域內(nèi)已知的多數(shù)方法主要使用用于消化的膠原酶或其它解離酶。然 而，使用諸如膠原酶的酶可能引起安全擔(dān)憂，因為膠原酶通常是從革蘭氏陽性細菌溶組織 梭狀芽胞桿菌(Clostridium Μstol}fticum)產(chǎn)生的。使用酶還使得難W進行質(zhì)量控制，因 為它具有保存期限且其活性存在批次間的變異性。另外，膠原酶消化要求長的加工時間（約 1小時）并且常常導(dǎo)致W細胞數(shù)目表示的產(chǎn)量的不一致性?？紤]到使用了源于細菌的膠原 酶，所述方法還需要進行充分洗涂，運導(dǎo)致分離或回收過程所設(shè)及的總的時間和成本增加。 另外，本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法還需要技術(shù)人員的大量手工處置，運增加了污染風(fēng)險。
[0008] 考慮到本領(lǐng)域內(nèi)所遇到的問題，存在著對提供用于從樣品回收基質(zhì)血管組分的替 代方法的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 在一個方面，提供用于從樣品回收基質(zhì)血管組分的方法。在一個示例中，所述方法 包括提供能夠?qū)悠菲扑槌蓡渭毎麘乙?、同時維持完整的基質(zhì)血管組分細胞的細胞結(jié)構(gòu)的 機械力，其中所述機械力是切碎和/或均質(zhì)化。
[0010] 在另一方面，提供治療需要細胞療法的受試者的方法。在一個示例中，該方面的治 療受試者的方法包括向有此需要的受試者施用由本公開的方法獲得的基質(zhì)血管組分的細 胞。
[0011] 在再一方面，提供治療需要細胞療法的受試者的方法。在一個示例中，該方面的治 療受試者的方法包括向需要細胞療法的受試者施用由本公開的方法獲得的脂肪來源的干 細胞。
【附圖說明】
[0012] 當結(jié)合非限制實施例和附圖考慮時，參考【具體實施方式】將更好地理解本發(fā)明，其 中：
[0013] 圖1顯示可在基質(zhì)血管組分中發(fā)現(xiàn)的細胞類型的圖解說明。圖1提供可通過本公開 的方法回收的細胞類型的示意圖。
[0014] 圖2顯示使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的典型酶促方法分離并且培養(yǎng)W富集脂肪來源的干細 胞后的細胞生長和形態(tài)的顯微鏡圖像。
[0015] 圖3顯示如在培養(yǎng)的第4天通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法（即通過酶方法)獲得的分離 的細胞樣品的顯微鏡圖像(在培養(yǎng)的第4天；WlOOx放大率）。
[0016] 圖4顯示在37°C解育1小時、之后均質(zhì)化65秒后的細胞樣品的顯微鏡圖像(在培養(yǎng) 的第4天；WlOOx放大率）。圖4顯示使用本公開的一種方法回收的細胞的細胞形態(tài)的顯微鏡 圖像。
[0017] 圖5顯示均質(zhì)化65秒后的分離的細胞樣品的顯微鏡圖像(在培養(yǎng)的第4天；WlOOx 放大率）。圖5顯示使用本公開的一種方法回收的細胞的細胞形態(tài)的顯微鏡圖像。
[0018] 圖6顯示切碎5分鐘后的分離的細胞樣品的顯微鏡圖像(在培養(yǎng)的第4天；WlOOx放 大率）。圖6顯示使用本公開的一種方法回收的細胞的細胞形態(tài)的顯微鏡圖像。
[0019] 圖7顯示在37°C預(yù)處理1小時、之后切碎5分鐘后的分離的細胞樣品的顯微鏡圖像 (在培養(yǎng)的第4天；WlOOx放大率）。圖7顯示使用本公開的一種方法回收的細胞的細胞形態(tài) 的顯微鏡圖像。
[0020] 圖8顯示描繪在進行本公開的方法之一（即切碎)后獲得的活細胞計數(shù)的數(shù)目的條 形圖。具體地說，條形圖顯示每5ml分離的脂肪組織的活細胞計數(shù)(在培養(yǎng)的第7天）。切碎組 的測量結(jié)果是Ξ個樣品的平均值。代表至少10次獨立實驗的數(shù)據(jù)。使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方 法獲得陽性對照，所述方法使用酶促消化;將陰性對照切碎10秒。
[0021] 圖9顯示描繪在與脂解劑（異丙腎上腺素和異下基甲基黃嚷嶺-IBMX)組合進行本 公開的方法之一后獲得的活細胞計數(shù)的數(shù)目的條形圖。具體地說，條形圖顯示每5ml分離的 脂肪組織的活細胞計數(shù)(在培養(yǎng)的第7天）。試劑組的測量結(jié)果是兩個樣品的平均值。代表至 少5次獨立實驗的數(shù)據(jù)。使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法獲得陽性對照，所述方法使用酶促消化； 將陰性對照切碎30秒。
[0022] 圖10顯示描繪在進行本公開的方法之一（即切碎10秒，之后均質(zhì)化65秒)后獲得的 活細胞計數(shù)的數(shù)目的條形圖。均質(zhì)化組的測量結(jié)果是Ξ個樣品的平均值。代表至少7次獨立 實驗的數(shù)據(jù)。使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法獲得陽性對照，所述方法使用酶促消化;將陰性對照 切碎10秒。
[0023] 附表簡述
[0024] 當結(jié)合非限制實施例和附表考慮時，參考【具體實施方式】將更好地理解本發(fā)明，其 中：
[0025] 表1顯示使用本公開的方法回收的脂肪來源的干細胞的百分比產(chǎn)率。
[0026] 表2顯示使用本公開的方法回收的脂肪來源的干細胞的百分比產(chǎn)率，其中所述方 法進一步包括使用如本文所述的非酶促試劑。
[0027] 表3顯示使用本公開的方法回收的脂肪來源的干細胞的百分比產(chǎn)率，其中所述方 法進一步包括其它分離方法的組合。
【具體實施方式】
[0028] 考慮到源于基質(zhì)血管組分的脂肪來源的干細胞可在醫(yī)學(xué)中提供的巨大可能性，需 要具有用于回收基質(zhì)血管組分的方法。因此，在一個方面，提供用于從樣品回收基質(zhì)血管組 分的替代方法。如本文所用的，短語"基質(zhì)血管組分"、"基質(zhì)血管組分的細胞"或"基質(zhì)血管 組分細胞"是指源于脂肪組織的血管（或設(shè)及攜帶血液的脈管）成分的細胞組分，其包含不 同的細胞類型，包括但不限于脂肪來源的干細胞(例如間充質(zhì)干細胞）、間充質(zhì)細胞、造血細 胞、造血干細胞/祖細胞、軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、內(nèi)皮前體細胞或祖細胞、內(nèi)皮細 胞、平滑肌細胞、周細胞、CD34+細胞(通常在廝帶中發(fā)現(xiàn)）、CD29+細胞、CD 166+細胞、Thy-1+ 或CD90+干細胞、CD44+細胞、免疫細胞如單核細胞、白細胞、淋己細胞、B細胞和T細胞、NK細 胞、巨隧細胞、樹突細胞、嗜中性白細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、粒細 胞、紅細胞、巨核細胞、血小板等，包括表達一種或多種W下標志物的免疫細胞和其它細胞： CD3、CD 14 (巨隧細胞標志物）、CD 19、CD20 (B細胞標志物）、CD29 (整聯(lián)蛋白單元）、CD31 (內(nèi)皮 細胞、血小板、巨隧細胞、樹突細胞、粒細胞、T/NK細胞、淋己細胞、巨核細胞、破骨細胞、中性 粒細胞等）、CD44(透明質(zhì)酸受體）、CD45(B細胞和Τ細胞標志物）、CD56、CD73(淋己細胞分化 標志物)和CD105。此外，基質(zhì)血管組分還可包括表達本公開中所公開的任一標志物或其任 意組合的細胞。如本文和本領(lǐng)域內(nèi)所用的，短語"前體細胞"、"祖細胞"和"干細胞"可互換使 用，并且是指多能或譜系未定（lineage-uncommitted)的祖細胞，所述細胞潛在能夠進行無 限次數(shù)的有絲分裂W自我更新或W產(chǎn)生將分化成期望的細胞類型的后代細胞。與多能干細 胞不同，譜系未定的祖細胞通常被認為不能產(chǎn)生大量表型上彼此不同的細胞類型。
[0029] 如本文所用的，術(shù)語"回收"、"分離"或"收獲"是指從組織的通常與組織的期望組 分或成分締合的周圍基質(zhì)提取所述組織的所述組分或成分的過程。在一個示例中，術(shù)語"回 收"、"分離"或"收獲"是指從脂肪組織提取基質(zhì)血管組分的動作。在另一示例中，術(shù)語"回 收"、"分離"或"收獲"是指從如由本公開的方法獲得的基質(zhì)血管組分提取脂肪來源的干細 胞的動作。
[0030] 由于用于回收基質(zhì)血管組分的已知方法通常設(shè)及解離酶如膠原酶，因此本公開提 供用于從樣品回收基質(zhì)血管組分的非酶促方法。也就是說，如本文所述的方法可不包括酶 消化，運與本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法不同，本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法包括在進行回收基質(zhì)血管組分 的方法之前或當時將酶添加到樣品中的步驟。換句話說，如本文所述的方法可不包括外源 酶消化。如本文所用的，術(shù)語"酶"是指能夠消化將細胞結(jié)合在一起W形成組織的細胞外基 質(zhì)的生物分子。在本公開中，所述酶可W是促進對細胞與細胞的接觸的消化或解離的解離 酶，如可促進組織消化成單細胞懸液的膠原酶、膜蛋白酶等。在本公開的方法中排除酶是為 了確?；厥栈|(zhì)血管組分和具有臨床等級的最終脂肪來源的干細胞并且具有最低污染風(fēng) 險。如本文所用的，術(shù)語"消化(digestion)"、"消化(digesting)