一種檢測aldh2基因*2多態(tài)性的引物與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種檢測ALDH2基因巧多態(tài)性的引物與 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙醒脫氨酶(ALDH2基因編碼）是酒精代謝的關(guān)鍵酶，其突變可影響酒精代謝進(jìn)而 引起乙醒等有害物質(zhì)的堆積，影響身體健康。ALDH2基因巧多態(tài)性(NM_000690.3:c.l510G> A，p.Glu504Lys)可導(dǎo)致乙醒脫氨酶酶活性顯著降低，乙醒代謝至乙酸速度較慢，促進(jìn)了體 內(nèi)乙醒的堆積。ALD肥基因巧基因多態(tài)性可導(dǎo)致飲酒后體內(nèi)乙醒堆積，當(dāng)血液中乙醒達(dá)到一 定濃度時(shí)，會(huì)出現(xiàn)面紅、頭痛、屯、動(dòng)過速、呼吸苦難等不適，表現(xiàn)為對(duì)酒精的不耐受性，稱為 面紅反應(yīng)。
[0003] 硝酸甘油是屯、絞痛急性發(fā)作時(shí)的常規(guī)首選藥物，但該藥的臨床療效常因人而異。 研究顯示，中國漢族人群中，硝酸甘油含服無效的比例高達(dá)25%W上，而ALDH2基因巧多態(tài)性 與部分國人含服硝酸甘油治療屯、絞痛無效相關(guān)。硝酸甘油主要的藥理作用是通過舒張血 管，降低屯、臟前后負(fù)荷，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，減少屯、肌耗氧，從而緩解屯、絞痛癥狀，而其舒張血管 作用主要是通過釋放NO所介導(dǎo)的。研究發(fā)現(xiàn)，乙醒脫氨酶是使硝酸甘油活化并釋放NO的關(guān) 鍵酶，硝酸甘油需先在體內(nèi)經(jīng)乙醒脫氨酶生物轉(zhuǎn)化，然后才能釋放出有藥理活性的一氧化 氮(NO)，發(fā)揮其抗屯、絞痛作用。ALDH2基因巧多態(tài)性導(dǎo)致乙醒脫氨酶酶活性顯著降低，從而 影響了硝酸甘油治療屯、絞痛的有效率。
[0004] 檢測ALDH2基因巧多態(tài)性對(duì)硝酸甘油的臨床用藥及指導(dǎo)人們健康飲酒具有重要的 意義。中國專利申請(qǐng)201510085568.2公開了一種檢測ADH1B基因的單一核巧多型性R49H的 基因型和ALD肥基因的單一核巧多型性E487K的基因型的引物組和定序引物，但其用于檢測 ALDH2基因*2和ADH1B基因巧多態(tài)性準(zhǔn)確度不足?，F(xiàn)有技術(shù)缺少一種檢測特異性和靈敏度 高、準(zhǔn)確性和精密性好的ALDH2基因巧多態(tài)性檢測引物及其方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種檢測ALDH2基因巧多態(tài)性的引物 與方法，具有檢測特異性和靈敏度高，準(zhǔn)確性和精密性好等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了ALDH2基因巧多態(tài) 性的檢測。本發(fā)明檢測的位點(diǎn)為ALDH2基因*2(NM_000690.3:c.l510G〉A(chǔ)，p.Glu5(MLys， rs671)〇
[0006] 本發(fā)明提供一種檢測ALDH2基因*2多態(tài)性的引物，包括PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot PCR引物;所述PCR擴(kuò)增引物為上游引物5'-TGGTGGCTACAAGATGTCG-3'（沈Q ID NO. 1)和下游 引物5'-6〔4661'(：仇4〔4(：1^4〔4-3'（569 10^.2);所述5化口3}1〇1?〔尺為針對(duì)5'-ACGGGCTGCAGGCATACACT-3'（沈Q ID N0.3)。
[0007] 采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供的檢測ALDH2基因*2多態(tài)性的引物，可W實(shí)現(xiàn) ALDH2基因巧多態(tài)性的特異性檢測，準(zhǔn)確性好。
[0008] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種檢測ALD肥基因巧多態(tài)性的方法，包括如下步驟： 51、 提取DNA樣品； 52、 W步驟S1所述的DNA樣本為模板，利用權(quán)利要求1中所述的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，； 53、 W步驟S2所述的純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用權(quán)利要求1中所述的挪aPshot PCR引物進(jìn)行SNaPshot PCR擴(kuò)增，并對(duì)SNaPshot PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； 54、 采用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)步驟S3所述的純化后的挪aPshot PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測， 并對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟S1中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血的DNA樣品。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟S2中的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:98°C預(yù)變性3min，98°C變性 10s，58°C退火30s，72°C延伸Imin，進(jìn)行29個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min，結(jié)束后25°C保溫。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟S3中的挪aPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:96°C變性10s，55°C退 火5s，60°C延伸30s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，結(jié)束后4°C保溫。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟S4中，采用GE肥MAP陽RID V4.1軟件對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行分析。
[001引此外，本發(fā)明還提供檢測AU)肥基因巧多態(tài)性的引物在制備檢測AL畑2基因巧多態(tài) 性試劑中的用途。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供了一種檢測ALDH2基因巧多態(tài) 性的引物，該引物的特異性和準(zhǔn)確性好，可用于實(shí)現(xiàn)ALDH2基因巧多態(tài)性的檢測，檢測效率 高。此外，本發(fā)明還提供了一種檢測ALDH2基因巧多態(tài)性的測aPshot法，通過使用特異性的 PCR擴(kuò)增引物和S化Pshot PCR引物，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性和精密性好等優(yōu)點(diǎn)，檢 測結(jié)果可W為硝酸甘油的臨床用藥與健康飲酒提供指導(dǎo)。
【附圖說明】
[001引圖1本發(fā)明提供的ALD肥基因*巧I物的部分?jǐn)U增片段。
[0016]圖2本發(fā)明提供的ALD肥基因*巧I物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測序圖。
[00Π ]圖3樣品的AU)肥基因巧多態(tài)性檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] W下內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于運(yùn)些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)化圍。
[0019] 實(shí)施例一引物 發(fā)明人針對(duì)ALDH2基因巧的基因多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了大量引物，通過引物反應(yīng)條件的優(yōu) 化和比較，篩選出了特異性好的引物。本發(fā)明提供的引物如表1所示。本發(fā)明提供的所有引 物序列均通過UCSC數(shù)據(jù)庫比對(duì)，無已知SNP位點(diǎn)。
[0020] 實(shí)施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的ALDH2基因巧引物于UCSC中進(jìn)行Blasting,結(jié)果如下:ALDH2基因巧擴(kuò) 增片段位于C虹12:112241598+112241871，長度為274bpDALD肥基因巧特異引物的擴(kuò)增片段 及基因組位置如圖1所示，引物的擴(kuò)增片段覆蓋了相應(yīng)的檢測位點(diǎn)ALDH2基因*2,無其它同 源基因。
[0021 ]使用表1中PCR擴(kuò)增引物分別對(duì)檢測樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增及Sanger測序，部分測序結(jié) 果如圖2所示。測序結(jié)果顯示，引物擴(kuò)增片段與ALD肥基因巧基因參考序列吻合。ALD肥基因* 2基因參考序列號(hào)為ALD肥 NC_000012.12，NM_000690.3。
[0022] 使用表1中測aPshot PCR引物，S化Pshot法進(jìn)行檢測，部分結(jié)果如圖3所示。從圖3 可知，產(chǎn)物峰的相對(duì)位置及測序反應(yīng)滲入的堿基與預(yù)期相符，且無其它干擾峰。
[0023] 實(shí)施例Ξ ALD肥基因巧多態(tài)性的檢測 1、提取抓TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANamp Blood DNA Kit(購自 Τ iagen，貨號(hào)D