Capg在制備診斷帕金森癥產(chǎn)品中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，設及一種用于帕金森癥診斷的分子標志物，具體設及 血液中的分子標志物-CAPG基因在制備診斷帕金森癥的產(chǎn)品中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森病是臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，W靜止性震顫、運動遲緩、肌強 直和姿勢步態(tài)異常等運動癥狀為主要表現(xiàn)，并常伴感覺障礙、睡眠障礙、自主神經(jīng)功能素亂 和神經(jīng)精神障礙等非運動癥狀;病理特征為黑質(zhì)多己胺能神經(jīng)元大量缺失，W及殘留神經(jīng) 元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，即路易小體化B)。帕金森病患者一般僅在多己胺能神經(jīng)元減 少50%、多己胺水平降低達70%-80%的情況下才表現(xiàn)出典型的運動癥狀，由于神經(jīng)元的不 可再生特點，此時患者已錯過了治療的最佳時機。因此，積極尋找具有早期診斷價值的生物 學標志物，在多己胺能神經(jīng)元存活時即明確診斷帕金森是生物學研究的熱點。
[0003] 目前，關(guān)于帕金森病早期診斷的生物化學標志物研究設及免疫學、炎癥反應、氧化 應激反應、細胞調(diào)亡等多個領(lǐng)域，其中W突觸共核蛋白（a-Syn)最具研究前景。組織病理學 研究顯示，帕金森病患者黑質(zhì)紋狀體突觸共核蛋白異常聚集、沉積及功能失調(diào)，而且突觸共 核蛋白是路易小體的主要成分，因此若在腦脊液、外周血或唾液等體液中檢測到突觸共核 蛋蛋白，則判斷受試者患有帕金森癥。但是W蛋白為疾病標志物的檢測方法缺乏特異性和 靈敏性，且相比基因檢測而言，蛋白檢測還不能完全體現(xiàn)"早期"檢測的概念，因此尋找一種 有效的能夠在早期即可診斷帕金森癥發(fā)生的基因標志物是亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于帕金森癥早期診斷 的分子標志物。相比傳統(tǒng)的帕金森癥的診斷方法，使用基因標志物來診斷帕金森癥的具有 及時性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風險，針對風險高低，采取 相應的預防和治療措施。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了檢測CAPG基因表達的產(chǎn)品在制備診斷帕金森癥的工具中的應用。
[0007] 進一步，上面所提到的檢測CAPG基因表達的產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、 免疫檢測、原位雜交、忍片或高通量測序平臺檢測CAPG基因表達水平W診斷帕金森癥的產(chǎn) 品。
[000引進一步，所述用RT-PCR診斷帕金森癥的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增CAPG基因的引 物;所述用實時定量PCR診斷帕金森癥的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增CAPG基因的引物;所述 用免疫檢測診斷帕金森癥的產(chǎn)品包括:與CAPG蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診 斷帕金森癥的產(chǎn)品包括:與CAPG基因的核酸序列雜交的探針;所述用忍片診斷帕金森癥的 產(chǎn)品包括：蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括與CAPG蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因 忍片包括與CAPG基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述用實時定量PCR診斷帕金森癥的產(chǎn)品至少包括 一對特異擴增〔4?6基因的引物的序列如56〇10^.3和56〇10^.4所示。
[0010] 優(yōu)選地，所述診斷工具包括忍片、試劑盒、試紙或高通量測序平臺。其中，高通量測 序平臺是一種特殊的診斷工具，檢測CAPG基因表達的產(chǎn)品可W應用于該平臺實現(xiàn)對CAPG基 因的表達情況的檢測。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構(gòu)建將成為 十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異 常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知CAPG基因的異常與帕金森癥相關(guān)也屬于CAPG基 因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種診斷帕金森癥的工具，所述診斷工具包括忍片、試劑盒、試 紙、或高通量測序平臺。
[0012] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍片;所述基因忍片包括固相載體W及固定 在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測CAPG基因轉(zhuǎn)錄水平的針對 CAPG基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質(zhì)忍片包括固相載體W及固定在固相載體的CAPG蛋白 的特異性抗體;所述基因忍片可用于檢測包括CAPG基因在內(nèi)的多個基因（例如，與帕金森癥 相關(guān)的多個基因）的表達水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測包括CAPG蛋白在內(nèi)的多個蛋白 質(zhì)(例如與帕金森癥相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達水平。通過將多個與帕金森癥的標志物同時 檢測，可大大提局帕金森癥診斷的準確率。
[0013] 其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測CAPG基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括CAPG蛋白的特 異性抗體。進一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或忍片方 法檢測CAPG基因表達水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對CAPG基因的引物 和/或探針。根據(jù)CAPG基因的核巧酸序列信息容易設計出可W用于檢測CAPG基因表達水平 的引物和探針。
[0014] 與CAPG基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍 生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結(jié)合，任 何長度都可W。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長 度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交 效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過 30個堿基對，與目的核巧酸序列互補的長度W15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列 最好少于4個堿基對，W免影響雜交效率。
[0015] 所述高通量測序平臺包括檢測CAPG基因表達水平的試劑。
[0016] 所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核巧酸，所述寡核巧酸能夠檢測 CAPG基因的轉(zhuǎn)錄水平。
[0017] 進一步，所述CAPG蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述CAPG蛋白 的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，，嵌合抗體、scFvJab、F (ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與CAPG蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體 的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可W使用任何方法來制備所述抗體。
[0018] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述針對CAPG基因的引物序列如下：正向引物序列 如SEQ ID NO. 3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。
[0019] 用于診斷帕金森癥的CAPG基因及其表達產(chǎn)物的來源包括但不限于血液、組織液、 尿液、唾液、脊髓液等可W獲得基因組DNA的體液。在本發(fā)明的具體實施方案中，用于診斷帕 金森癥的CAPG基因及其表達產(chǎn)物的來源是血液。
[0020] 在本發(fā)明的上下文中/'CAPG基因"包括CAPG基因 W及CAPG基因的任何功能等同物 的多核巧酸。CAPG基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中CAPG基因（NC_ 000002.12)DNA序列具有70% W上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DM序列；
[0021 ] 優(yōu)選地，CAPG基因的編碼序列包括W下任一一種DNA分子：
[0022] (1)序列表中沈Q ID N0.1所示的DNA序列；
[0023] (2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0024] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90% W上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0025] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述CAPG基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的DNA 序列。
[00%]在本發(fā)明的上下文中，CAPG基因表達產(chǎn)物包括CAPG蛋白W及CAPG蛋白的部分膚。 所述CAPG蛋白的部分膚含有與帕金森癥相關(guān)的功能域。
[0027] "CAPG蛋白"包括CAPG蛋白W及CAPG蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 CAPG蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘 導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與CAPG的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[00%]優(yōu)選地，CAPG蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0029] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0030] (2)將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數(shù)通常為1-50個，較佳地1-30 個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。
[0031] (3)與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 更優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[0032] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述CAPG蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0033] 通常，已知的是，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0034] 通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是CAPG蛋白的融合 蛋白。對于與CAPG蛋白融合的膚或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留CAPG蛋白 的生物學活性即可。
[0035] 本發(fā)明的CAPG蛋白也包括對SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留CAPG蛋白的生物學活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變的 氨基酸數(shù)目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。
[0036] 在本發(fā)明的上下文中，"診斷帕金森癥"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有帕金森 癥、也包括判斷受試者是否存在患有帕金森癥的風險。
[0037] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0038] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了CAPG基因表達與帕金森癥相關(guān)，通過檢測受試者中CAPG的表 達，可W判斷受試者是否患有帕金森癥、或者判斷受試者是否存在患有帕金森癥的風險，從 而指導臨床醫(yī)師給受試者提供預防方案或者治療方案。
[0039] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標記物-CAPG基因，相比傳統(tǒng)的檢測手段，基因診斷更 及時、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)帕金森癥的早期診斷，從而降低帕金森癥的死亡率。
【附圖說明】
[0040] 圖1顯示利用QPCR檢測CAPG基因在帕金森癥患者和正常人中的表達差異。
[0041] 具體的實施方式
[0042] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。W下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0043] 實施例1篩選帕金森癥患者和正常人中差異表達的基因
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