越南槐內(nèi)生真菌grph-0在防治白色念珠菌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0在防治白色念 珠菌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白色念珠菌是人體的一種常見的條件致病性真菌，在機體免疫力下降或免疫系統(tǒng) 受到損害時，其大量繁殖而致病。近20年來由于臨床上對腫瘤患者、器官移植患者大量使用 抗腫瘤藥物、抗菌劑和免疫抑制劑，以及慢性消耗性疾病、艾滋病的流行，使白色念珠菌感 染的發(fā)生率在免疫受損的患者群體中急劇升高。白色念珠菌感染已日益成為一種常見病、 多發(fā)病，死亡率逐年增高。目前臨床上治療白色念珠菌感染常用的藥物主要有唑類如氟康 唑、多烯類如兩性霉素 B和嘧啶類如5-氟胞嘧啶，但隨著這些抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致 了大量耐藥菌株的出現(xiàn)，因此，白色念珠菌感染已成為日益嚴重的問題，給臨床治療帶來很 大的困難和挑戰(zhàn)，急需研制新型的抗真菌藥物。
[0003] 隨著藥用植物中分離出的新天然活性物質(zhì)的減少，亟需新的研發(fā)策略發(fā)現(xiàn)新型天 然藥物。近10年來，人們把目光投向了藥用植物內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌與宿主植物協(xié)同進化， 多樣性明顯，這些特點決定了其次生代謝產(chǎn)物的獨特性、豐富性，因此從藥用植物內(nèi)生真菌 的次生代謝產(chǎn)物中容易發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的化合物。許多源于藥用植物內(nèi)生真菌的 次生代謝產(chǎn)物被鑒定出具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲、抗HIV以及酶抑制劑等多種生物學(xué) 活性。藥用植物內(nèi)生真菌所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的化合物為新型抗真菌藥物的發(fā)現(xiàn) 提供了重要的先導(dǎo)化合物和新的藥物作用靶點，成為天然活性產(chǎn)物和新藥開發(fā)的重要來 源。
[0004] 公開于該【背景技術(shù)】部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng) 當(dāng)被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技 術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0在防治白色念珠菌中的應(yīng)用， 該真菌對耐藥性的白色念珠菌具有非常顯著的抑制作用。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
[0007] 一種越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0,越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0的分類命名為漆斑菌 (Myrothecium sp.)GRPH-〇,菌株的ITS序列如SEQ ID N0.1所述，保藏單位：中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué) 院微生物研究所，保藏日期:2015年09月29日，保藏號:CGMCC No. 11391。
[0008] 優(yōu)選的是，所述越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0的代謝產(chǎn)物的制備方法為：
[0009] (1)將越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0接種PDA培養(yǎng)基中，置于溫度為28°C下培養(yǎng)20天，所 得培養(yǎng)材料切成塊狀并轉(zhuǎn)移到無菌固體培養(yǎng)基，置于28°C發(fā)酵30天；
[0010] (2)發(fā)酵完成后，用發(fā)酵物2倍的甲醇浸泡發(fā)酵物并超聲40min，然后過濾；
[0011] (3)重復(fù)步驟(2)兩次，合并兩次濾液進行減壓濃縮成浸膏，得到越南槐內(nèi)生真菌 GRPH-0的甲醇粗提物，即為越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0代謝產(chǎn)物。
[0012] 優(yōu)選的是，步驟（1)中所述的無菌固體培養(yǎng)基含400g馬鈴薯，20g的右旋糖和20g蔗 糖。
[0013] 優(yōu)選的是，所述的PDA培養(yǎng)基組成為1000ml培養(yǎng)基含馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂 20g和氯霉素0. lg;所述培養(yǎng)基pH 6.0 ±0.2，采用121°C濕熱滅菌25min。
[0014] 如上述制備所得的越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0的代謝產(chǎn)物在防治白色念珠菌中的應(yīng) 用。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0016] (1)本發(fā)明首次從藥用植物越南槐的根中分離篩選到一株內(nèi)生真菌(Myrothecium Sp.)GRPH-〇,該菌的代謝產(chǎn)物具有抗真菌活性作用，對白色念珠菌具有非常顯著的抑制作 用；
[0017] (2)所述的制備越南槐內(nèi)生真菌(Myrothecium sp. )GRPH-0代謝產(chǎn)物的方法簡單 易行，成本低。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0抑菌圈，其中a為陽性對照，b為越南槐內(nèi)生真 菌GRPH-0菌株菌餅。
[0019] 圖2為本發(fā)明越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0菌株形態(tài)特征，其中a為菌落形態(tài)，b為孢子形 ??τ 〇
[0020] 圖3為本發(fā)明越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0菌株基于ITS序列的系統(tǒng)進化樹。
[0021] 圖4為本發(fā)明越南槐內(nèi)生真菌GRPH-0菌株的代謝產(chǎn)物對白色念珠菌的最小抑菌濃 度，其中&為無菌對照，&為無藥物的生長對照，C 3為陽性對照兩性霉素 B，T為菌株GRPH-0的 代謝產(chǎn)物。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合【具體實施方式】進行詳細描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體 實施方式的限制。下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得 至 1J。甲醇為市購分析純甲醇。2X TagMasterMix購自寶生物工程有限公司（Takara)，Primer-1、Primer_2由華大基因合成。
[0023] 實施例1
[0024]菌株的分離、篩選及鑒定
[0025] 一、菌株的分離
[0026]供試材料:采自廣西大學(xué)藥用植物標本園的栽培越南槐。
[0027]培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：1000ml培養(yǎng)基含馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂20g、氯霉素 〇.1&，培養(yǎng)基口!16.0±0.2，采用121°(3濕熱滅菌251^11。
[0028] 表面消毒:將長為6-8cm、寬為l-2cm新鮮健康的越南槐根用流水沖洗30min以沖干 凈泥沙，然后將洗凈的越南槐根用無菌水漂洗2次，風(fēng)干表面水分，移到超凈工作臺，在無菌 條件下，將越南槐根用體積濃度為75%乙醇浸泡lmin，無菌水漂洗2次，次氯酸鈉(有效氯 1 % )浸泡2min，無菌水洗3次，無菌吸水紙吸干表面?zhèn)溆谩?br>[0029] 菌株的分離、純化:表面消毒好的越南槐根，無菌條件下，用無菌木片刮去表皮，用 無菌枝剪剪去越南槐根的兩端，余下部分用無菌小刀和無菌鑷子分開木質(zhì)部和韌皮部，并 用無菌枝剪剪成0.5cm長的組織塊，無菌轉(zhuǎn)接至制備好的TOA培養(yǎng)基(含氯霉素），28°C培養(yǎng)。 取最后一次漂洗液涂布在TOA平板上，作為陰性對照。每天觀測，待組織周圍長出菌絲，挑取 單一菌絲，接于無抗生素的PDA培養(yǎng)基。長出的菌落，如果外部形態(tài)不一致，繼續(xù)挑取單一菌 絲轉(zhuǎn)接PDA培養(yǎng)基，直至平板上新長出的菌落的外部形態(tài)一致。
[0030] 二、篩選
[0031] 供試菌株:購自美國菌種保存庫(ATCC)的白色念珠菌模式菌株ATCC90028。
[0032] 培養(yǎng)基
[0033] (1)沙保羅瓊脂培養(yǎng)基（SDB):麥芽糖40g，蛋白胨10g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH 6.0 ±0·2〇
[0034] (2)ΜΗ瓊脂(ΜΗΑ):牛肉粉6g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，瓊脂17g，蒸餾 水lL，pH 7.3±0.1。
[0035] (3)MHA+GMB:MH瓊脂添加2 % 的葡萄糖(G)和0 · 5yg/mL的美蘭(MB)。
[0036]將分離到的越南槐內(nèi)生真菌接種于TOA平板內(nèi)，28°C下培養(yǎng)10天后待用。將白色念 珠菌接種于SDB平板內(nèi)，37°C下培養(yǎng)24小時后待用。
[0037]采用改良的瓊脂擴散法對供試越南槐內(nèi)生真菌進行菌體抑菌活性的篩選。
[0038]首先，經(jīng)SDB培養(yǎng)的白色念珠菌新鮮菌落，采用直接菌落懸液法，挑取4~5個菌落 于5ml生理鹽水中并調(diào)節(jié)菌液池度為0.5麥氏池度，調(diào)好池度的菌懸液在15min內(nèi)用無菌棉 簽均勻涂布于MHA+GMB平板上，平板涂好菌液后，放置3~5min風(fēng)干。然后在無菌條件，用打 孔器將待篩選的內(nèi)生真菌制成6mm的菌餅，并接入到涂布有白色念珠菌的MHA+GMB平板，以 接入含l〇yg氟康唑的6mm瓊脂塊為陽性對照，平板置于37°C培養(yǎng)。最后，平板培養(yǎng)24h后，觀 察越南槐內(nèi)生真菌菌餅或陽性對照周圍有無抑菌圈，并測量抑菌圈的直徑，結(jié)合陽性對照 抑菌圈直徑來判定菌株的抑菌活性大小。
[0039] 結(jié)果
[0040] 表1為用改良的瓊脂擴散法篩選越南槐內(nèi)生真菌菌株GRPH-0對白色念珠菌的拮抗 作用所得數(shù)據(jù)
[0041] 表1
[0042]
[0043] 注:表中陽性對照氟康唑瓊脂塊含10yg氟康唑，抑菌圈直徑包含6mm的瓊脂塊或菌 餅直徑。
[0044]越南槐內(nèi)生真菌菌株GRPH-0對白色念珠菌的拮抗篩選結(jié)果表明，該菌株對白色念 珠菌有非常強的拮抗作用，從表1可知，該菌株菌餅的抑菌圈為25mm，而10yg氟康唑陽性對 照的抑菌圈僅為22_，如圖1所示。所以，該菌6_菌餅的抑菌活性大于10yg氟康唑的抑菌活 性，該菌株對白色念珠菌具有非常顯著的抑制作用。
[0045] 三、鑒定
[0046](一)菌株形態(tài)特征
[0047]菌落形態(tài)特征觀察:將待鑒定的越南槐內(nèi)生真菌菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28 °C培養(yǎng)，分別在5、10及20天觀察其培養(yǎng)特征和顏色變化。取穩(wěn)定成熟的顏色特征作為其培 養(yǎng)特征，作為鑒定的依據(jù)。觀察記錄氣生菌絲的顏色，菌落的大小、顏色、組織形狀、表面形 狀等作為參考特征。
[0048]孢子形態(tài)特征觀察:將待鑒定的越南槐內(nèi)生真菌菌株GRPH-0作插片培養(yǎng)，當(dāng)在TOA 培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢子，將菌絲轉(zhuǎn)接于含無菌越南槐根的低營養(yǎng)培養(yǎng)基（四分之一濃度PDA)上 以誘導(dǎo)孢子，將所觀察到的形態(tài)結(jié)果顯微照相，結(jié)果如圖2所示。
[0049](二)菌株ITS序列及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 [0050] DNA模板的制備
[0051] 試劑：（1)裂解緩沖液：Tris-Ac(pH 7.8)40mM，NaAc 20mM，EDTA lmM，SDS l%(w/ v)；
[0052] (2)δΜ NaCl溶液。
[0053] DNA 提?。?br>[0054] 加600yL提取液（Tris-Ac(pH 7.8)40mM，NaAc 20mM，EDTA lmM，SDS 1%)到 1.5ml 離心管(EP管），用棒刮取少量菌絲放入EP研磨，65°C水浴30min;12000r/min，轉(zhuǎn)lOmin;