發(fā)酵法高密度培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及小球藻的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及發(fā)酵法高密度培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]小球藻為綠藻門小球藻屬的普生性單細(xì)胞藻類，是一種簡單的光合作用有機(jī)體，最常見的蛋白核小球藻以含有豐富的蛋白質(zhì)而被應(yīng)用于商業(yè)開發(fā)，同時(shí)還富含多種維生素、多糖、不飽和脂肪酸、氨基酸、膳食纖維、微量元素及其它活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗輻射、抗感染、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、降血脂、防治貧血等一系列生理保健作用，是目前保健食品應(yīng)用中能進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的微藻之一。
[0003]目前，小球藻的大規(guī)模培養(yǎng)主要采用戶外開放池，存在藻細(xì)胞密度低、品質(zhì)低、易污染等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述小球藻大規(guī)模培養(yǎng)中存在的問題，本發(fā)明提出了一種發(fā)酵法高密度培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)工藝，該工藝采用發(fā)酵罐內(nèi)流加營養(yǎng)物質(zhì)的方式對(duì)小球藻進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，不僅可以實(shí)現(xiàn)純種培養(yǎng)，還能較高程度的提高藻類品質(zhì)，蛋白質(zhì)及干重含量較高，同時(shí)還含有其他多種維生素，符合人體營養(yǎng)需求。
[0005]其技術(shù)解決方案包括:
[0006]—種培養(yǎng)小球藻的生產(chǎn)工藝，依次包括以下步驟:
[0007]a選取優(yōu)質(zhì)小球藻藻種并將其活化，接種培養(yǎng)，使小球藻種子液的濃度在8?I Ig/L；
[0008]b異樣培養(yǎng)，包括四個(gè)階段:
[0009]匕第一階段:將步驟a培養(yǎng)至生長對(duì)數(shù)期的小球藻種子液，接入150L的種子罐中進(jìn)行異樣培養(yǎng)，其中，150L的種子罐中培養(yǎng)基組成如下:
[0010]葡萄糖:30-60g/L，硫酸鎂:0.5-1.6g/L，檸檬酸鈣:0.1-0.5g/L，磷酸鈉:1.0-2.0g/L，磷酸氫二鉀:0.3-0.8g/L，硫酸亞鐵:0.05-0.lg/L,乙二胺四乙酸二鈉:0.3-0.6g/L，尿素:3-8g/L，微量元素和水；
[0011]培養(yǎng)控制條件:
[0012]溫度:30-35。。，罐壓:0.03-0.08MPa，風(fēng)量:1.0-2.0vvm,D0>20% ,pH:5.5-7.5；
[0013]匕第二階段:待第一階段小球藻種子液培養(yǎng)24?32h、碳源耗盡溶氧反彈且小球藻種子液干重在20?25g/L、pH在6?7培養(yǎng)正常時(shí)，將其接種至1.5方罐中異樣培養(yǎng);反之，重新進(jìn)入第一階段培養(yǎng)；
[0014]該階段的培養(yǎng)基組成與第一階段種子罐中的培養(yǎng)基成分相同，并且，培養(yǎng)控制條件也與第一階段培養(yǎng)控制條件相同；
[0015]b3第三階段:待二階段小球藻種子液培養(yǎng)24?32h、碳源耗盡溶氧反彈且小球藻種子液干重在20?25g/L、pH在6?7培養(yǎng)正常時(shí)，將其接種至17方罐中異樣培養(yǎng);反之，重新進(jìn)入第二階段培養(yǎng)；
[0016]該階段的培養(yǎng)基組成與第一階段種子罐中的培養(yǎng)基成分相同，并且，培養(yǎng)控制條件也與第一階段培養(yǎng)控制條件相同；
[0017]b4第四階段:待待三階段小球藻種子液培養(yǎng)24?32h、碳源耗盡溶氧反彈且小球藻種子液干重在20?25g/L、pH在6?7培養(yǎng)正常時(shí)，將其接種至50方罐中異樣培養(yǎng);反之，重新進(jìn)入第三階段培養(yǎng)；
[0018]所述50方罐中的培養(yǎng)基分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基，所述流加培養(yǎng)基分為四次加入；
[0019]基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成如下:
[0020]葡萄糖:50-60g/L，硫酸鎂:0.8-1.6g/L，檸檬酸鈣:0.2-0.5g/L，磷酸鈉:1.0-2.0g/L，磷酸氫二鉀:0.4-0.8g/L，硫酸亞鐵:0.08-0.lg/L,乙二胺四乙酸二鈉:0.3-0.6g/L，尿素:3-8g/L，微量元素和水；
[0021]流加培養(yǎng)基的組成如下:
[0022]葡萄糖:200g/L，硫酸鎂:4g/L，檸檬酸鈣:1.5g/L，磷酸鈉:5g/L，磷酸氫二鉀:2g/L，硫酸亞鐵:0.4g/L，乙二胺四乙酸二鈉:2g/L，尿素:15g/L，微量元素和水；
[0023]c誘導(dǎo)培養(yǎng)，
[0024]待第四階段培養(yǎng)至碳源耗盡、溶氧反彈時(shí)，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度為30?35°C，罐壓:0.04?0.06MPa，風(fēng)量:1.5?2.0vvm，尿素含量> 4g/L。
[0025]上述技術(shù)方案中，在異樣培養(yǎng)階段，依次從第一階段到第四階段，前三階段的培養(yǎng)利于藻種的穩(wěn)定生長，在第四階段，通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基的配合，利于對(duì)蛋白核小球藻進(jìn)行高密度異養(yǎng)培養(yǎng)，分次添加流加培養(yǎng)基，利于小球藻的生長。
[0026]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，步驟In中，微量元素配方為:硫酸錳:4.0_8mg/L，硫酸鋅:0.5-0.8mg/L，鉬酸:0.1-0.5mg/L，硫酸銅:0.1-0.8mg/L，硼酸:10_15mg/L。
[0027]作為本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案，流加培養(yǎng)基的具體加入方式為:當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)20?25h，且碳源耗盡、溶氧反彈、pH在6?7.5時(shí)，第一次加入流加培養(yǎng)基；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)32?38h，且碳源耗盡、溶氧反彈，pH在6?7.5時(shí)，第二次加入流加培養(yǎng)基；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)43?47h，且碳源耗盡、溶氧反彈，pH在6?7.5時(shí)，第三次加入流加培養(yǎng)基；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)53?57h，且碳源耗盡、溶氧反彈，pH在6?7.5時(shí)，第四次加入流加培養(yǎng)基。
[0028]優(yōu)選的，步驟b4中流加培養(yǎng)基中微量元素的配方為:
[0029]硫酸猛:25mg/L，硫酸鋅:2.5mg/L，鉬酸:1.5mg/L，硫酸銅:2.5mg/L，硼酸:50mg/L。
[0030]本發(fā)明所帶來的有益技術(shù)效果:
[0031 ]本發(fā)明發(fā)酵法高密度培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)工藝，既能保持小球藻高密度狀態(tài)，又能獲得高含量的蛋白和葉綠素，為工業(yè)化生產(chǎn)蛋白核小球藻提供了高效的培養(yǎng)方法。
[0032]本發(fā)明通過流加碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素，能快速積累蛋白核小球藻藻體濃度，縮短異樣培養(yǎng)周期，大幅降低生產(chǎn)成本。
[0033]本發(fā)明發(fā)酵法高密度培養(yǎng)小球藻，誘導(dǎo)工藝能大幅提高蛋白核小球藻蛋白含量，葉綠素含量。
【附圖說明】
[0034]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明:
[0035]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1菌體干重和蛋白含量隨時(shí)間變化圖；
[0036]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2菌體干重和蛋白含量隨時(shí)間變化圖；
[0037]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3菌體干重和蛋白含量隨時(shí)間變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0039]本發(fā)明所培養(yǎng)的小球藻，為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻，是一種球形單細(xì)胞淡水藻類，直徑3?8微米。
[0040]在上述生產(chǎn)工藝中的藻種是通過商業(yè)渠道購買獲得的優(yōu)質(zhì)藻種，在配置培養(yǎng)基中所需的原料也可通過商業(yè)渠道購買獲得。
[0041 ] 實(shí)施例1:
[0042]本發(fā)明，小球藻的生產(chǎn)工藝，具體采用下述方法:
[0043](I)將活化小球藻藻種，新接的搖瓶放入搖床中光照培養(yǎng)，正常培養(yǎng)3天后按照傳代操作接入5L搖瓶培養(yǎng)3天為2代，繼續(xù)傳代，傳至第3代時(shí)，在搖床中光照培養(yǎng)，正常培養(yǎng)3天后測(cè)藻液濃度達(dá)到10g/L;
[0044](2)將步驟(I)培養(yǎng)生長對(duì)數(shù)期的小球藻種子液，按10% (v/v)接入150L種子罐中進(jìn)行異樣培養(yǎng)；
[0045]150L種子罐定容100L，
[0046]培養(yǎng)基配方為:
[0047]葡萄糖:30-60g/L，硫酸鎂:0.5-1.6g/L，檸檬酸鈣:0.1-0.5g/L，磷酸鈉:1.0-2.0g/L，磷酸氫二鉀:0.3-0.8g/L，硫酸亞鐵:0.05-0.lg/L,乙二胺四乙酸二鈉:0.3-0.6g/L，尿素:3-8g/L，微量元素，水；
[0048]其中微量元素配方為硫酸錳:4.0-8mg/L，硫酸鋅:0.5-0.8mg/L，鉬酸:0.1 -0.5mg/L，硫酸銅:0.l-0.8mg/L，硼酸:10-15mg/L;
[0049]培養(yǎng)控制條件:
[0050]溫度:30-35。。，罐壓:0.03-0.08MPa，風(fēng)量:1.0-2.0vvm，DO 2 20 %，pH: 5.5-7.5。
[0051](3)將步驟(2)小球藻培養(yǎng)24小時(shí)，碳源耗盡溶氧反彈，測(cè)定藻液干重21.5g/L，PH:7.0時(shí)，取無菌樣鏡檢、無菌培養(yǎng)正常，接入1.5方罐中；
[0052]1.5方種子罐定容I方；
[0053]培養(yǎng)基配方:
[0054]葡萄糖:30-60g/L，硫酸鎂:0.5-1.6g/L，檸檬酸鈣:0.1-0.5g/L，磷酸鈉:1.0-2.0g/L，磷酸氫二鉀:0.3-0.8g/L，硫酸亞鐵:0.05-0.lg/L,乙二胺四乙酸二鈉:0.3-0.6g/L，尿素:3-8g/L，微量元素，水；
[0055]其中微量元素配方為硫酸錳:4.0-8mg/L，硫酸鋅:0.5-0.8mg/L，鉬酸:0.1-0.5mg/L，硫酸銅:0.l-0.8mg/L，硼酸:10-15mg/L。
[0056]培養(yǎng)控制條件:
[0057]溫度:30-35°C，罐壓:0.03-0.08MPa，風(fēng)量:1.0-2.0vvm,D0>20% ,pH:5.5-7.5；
[0058](4)步驟(3)小球藻培養(yǎng)24小時(shí)，碳源耗盡溶氧反彈時(shí)，藻液干重能達(dá)到22.5g/L，PH: 6.9時(shí)，取無菌樣鏡檢、無菌培養(yǎng)正常時(shí)，接入17方罐中；
[0059]17方種子定容9方；
[0060]培養(yǎng)基配方:
[0061 ]葡萄糖:30-60g/L，硫酸鎂:0.5-1.6g/L，檸檬酸鈣:0.1-0.5g/L，磷酸鈉:1.0-2.0g/L，磷酸氫二鉀:0.3-0.8g/L，硫酸亞鐵:0.05-0.lg/L,乙二胺四乙酸二鈉:0.3-0.6g/1，尿素:3-88/1^，微量元素，水。其中微量元素配方為硫酸錳:4.0-811^/1^，硫酸鋅:0.5-