一種靈芝菌種提純復壯的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物菌種選育技術領域，尤其是一種靈芝菌種提純復壯的方法。 技術背景
[0002] 靈芝是一種廣泛培植的重要藥用真菌，生產用菌種同其他微生物一樣存在著退化 問題。目前，我國靈芝各培植基地生產用的第一代母種基本都是引進的，引進的一級母種種 性優(yōu)良，在之后多次轉接原種、生產種時，培養(yǎng)基的組分皆由80%~85%木肩、15%~20% 麥麩或米糠構成，沒有充分考慮靈芝菌種在培植生產的不同階段對營養(yǎng)需求的變化，在兩 代過后，靈芝生長不斷弱勢，抗逆性差，最終導致種植戶減產甚至絕產。
[0003] 目前，靈芝培植生產時表現為：
[0004] 第一代(年）：菌絲吃料很快、培養(yǎng)基菌絲始終粗壯潔白、生長周期長、產量高品質 高、生物轉換率都能2 5.3%，而且抗逆性很強，即使在普通種植戶的簡陋接種養(yǎng)菌條件環(huán) 境，或村莊人畜生活附近的不夠清潔環(huán)境培植場地，也能達到污染報廢率為零或極少，污染 率 < 1%;
[0005] 第二代(年）：引進的母種經繼代保存，或組織分離的，菌絲吃料快或較快、培養(yǎng)基 菌絲生長始終比較粗壯潔白、生長周期較長、產量高品質好、生物轉換率能達到5%，抗逆性 較強、污染率低于<3%;
[0006] 第三代(年）：引進的母種再繼代保存或組織分離的，菌絲吃料變慢、培養(yǎng)基菌絲生 長不夠粗壯、潔白持續(xù)的時間減短、生長成熟周期縮短、產量與品質比較好、生物轉換率4.5 ~4.9%、抗逆性較弱、生產種和培養(yǎng)基菌木污染報廢率達5~10%，約5%左右的子實體背 面出現有壞死斑塊；
[0007] 第四代、第五代(年)及以后:母種為再繼代保存或組織分離的，菌絲吃料緩慢、培 養(yǎng)基菌絲生長細弱、40日齡以上的菌絲通常變?yōu)樽厣邏K、生長成熟周期大大縮短，從原 種、生產種到培養(yǎng)基菌木均常常出現一一培養(yǎng)基料表面尚有1/3、1/4甚至1/2的面積菌絲遲 遲未能吃到位，而接種點就長出子實體了。一經脫袋覆土后的培養(yǎng)基菌木污染報廢率大多 高達30%以上，生物轉換率均降低到4.3%以下，每每不乏絕收。而每當此時一般只能依靠 再引進"新"母種，來提高靈芝生產的生物轉換率、降低污染報廢率，增加了生產成本。

【發(fā)明內容】

[0008] 針對上述現有技術，本發(fā)明的目的在于克服現有技術中靈芝菌種經多次繼代培養(yǎng) 后生物轉換率低、污染報廢率大幅增加的問題，從而提供一種靈芝繼代培養(yǎng)后仍然穩(wěn)定高 產、抗逆性強、菌棒生物轉化率2 5 %的靈芝菌種提純復壯的方法。
[0009] 為了實現上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案，一種靈芝菌種提純復壯的方法，包 括以下步驟：
[0010] (1)菌種的初次篩選培養(yǎng):采用三代及三代以內的健壯的靈芝個體組織分離提取 母種，以瓊脂、或小米配合馬鈴薯為培養(yǎng)基，常規(guī)斜面培養(yǎng)10~15天，再置于超低溫-80~- 50°C保藏；
[0011] (2)第二次培養(yǎng):選取步驟(1)培養(yǎng)的靈芝菌種，以小米粉與櫟樹葉汁為培養(yǎng)基，常 規(guī)斜面培養(yǎng)10~15天，再進行超低溫保藏；
[0012] (3)第三次培養(yǎng):選取步驟(2)培養(yǎng)的靈芝菌種，以小米粉與櫟樹葉粉為培養(yǎng)基，常 規(guī)斜面培養(yǎng)10~15天，再進行超低溫保藏；
[0013] (4)第四次培養(yǎng):選取步驟(3)培養(yǎng)的靈芝菌種，以櫟樹葉粉、Vb 1和水為培養(yǎng)基，常 規(guī)斜面培養(yǎng)，當菌絲生長滿試管時停止培養(yǎng)，再進行超低溫保藏；
[0014] (5)擴展原種:選取步驟(4)培養(yǎng)的靈芝菌種，以櫟樹木肩、麥麩或米糠的混合物為 培養(yǎng)基，使用廣口瓶、棉塞常規(guī)培養(yǎng)18~25天，然后更換棉塞為四層醫(yī)用紗布封罩瓶口，繼 續(xù)培養(yǎng)1〇~20天并保藏；
[0015] (6)擴轉生產種:選取步驟(5)培養(yǎng)的靈芝菌種，以櫟樹木肩、麥麩或米糠的混合物 為培養(yǎng)基，經蒸汽滅菌、分袋、接種，并加扎外袋罩護，常規(guī)培養(yǎng)，當接種孔發(fā)菌直徑8~10cm 后覆膜去外罩護袋，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)一共培養(yǎng)30~40天并保藏；
[0016] (7)應用生產:將步驟(6)培養(yǎng)的靈芝菌種用于車間規(guī)?；a。
[0017] 進一步地，所述步驟(2)第二次培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基組分質量比為小米粉:櫟樹葉汁 = (2.6~3.5):1，優(yōu)選為小米粉:櫟樹葉汁=3:1。
[0018]進一步地，所述步驟(3)第三次培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基組分質量比為小米粉:櫟樹葉粉 = (0.5~1.5):1，優(yōu)選為小米粉:櫟樹葉粉=1:1。
[0019]進一步地，所述步驟(4)第四次培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基的質量組分為:櫟樹葉粉800~ 1200份、Vbl0.0 3~0.07份、水1300~1700份，優(yōu)選為:櫟樹葉粉1000份、Vbl0.0 5份、水1500 份。
[0020] 進一步地，所述步驟（1)、步驟(2)、步驟(3)中使用試管、棉塞常規(guī)斜面培養(yǎng)，當菌 絲離試管底端距離為3~7mm時停止培養(yǎng)。
[0021] 進一步地，所述步驟(5)中使用廣口瓶、棉塞常規(guī)培養(yǎng)，當培養(yǎng)發(fā)菌至廣口瓶中一 半時換棉塞為四層醫(yī)用紗布封罩瓶口，繼續(xù)培養(yǎng)，當廣口瓶中菌絲發(fā)滿時，停止培養(yǎng)并保 藏。
[0022] 進一步地，所述步驟(5)擴展原種、步驟(6)擴轉生產種所用的培養(yǎng)基的質量組分 為:櫟樹木肩700~750份、麥麩或米糠220~280份、黃豆粉15~25份、石膏8~13份、水1100 ~1300份。
[0023] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供的靈芝菌種提純復壯的方法，充分考慮靈芝 菌種在培植生產的不同階段對營養(yǎng)需求的變化，利用不同的培養(yǎng)基，可以有效解決靈芝菌 種在長期傳代培養(yǎng)導致的菌種退化問題;通過在菌種的初次篩培到車間大生產培養(yǎng)之間增 加多次中間過渡培養(yǎng)，在多次過渡培養(yǎng)培養(yǎng)基中分別添加櫟樹葉汁、櫟樹葉粉、櫟樹木肩 等，實現培養(yǎng)基的逐步變化，使菌種漸漸適應大生產的櫟樹段木培養(yǎng)基環(huán)境，提高靈芝菌種 生產的生物轉換率、降低污染報廢率，為靈芝的規(guī)?；沙掷m(xù)性生產提供了菌種保障。
【具體實施方式】
[0024] 對本發(fā)明的【具體實施方式】作如下說明：
[0025] -種靈芝菌種提純復壯的方法，包括以下步驟：
[0026] (1)菌種的初次篩選培養(yǎng):在每年7月份，采用三代及三代以內的健壯的靈芝個體 組織分離提取母種，以瓊脂、或小米配合馬鈴薯為培養(yǎng)基，使用試管、硅膠塞常規(guī)斜面培養(yǎng) 10~15天，當靈芝菌絲生長至離試管底端3~7mm時停止培養(yǎng);再將試管置于超低溫-80~-50°C保藏至10月份，超低溫保藏使菌絲處于休眠狀態(tài)，滿足生產周轉需要。
[0027] (2)第二次培養(yǎng):選用步驟（1)培養(yǎng)的靈芝菌種試管，取距離試管底端3~10mm、靈 芝菌絲濃密規(guī)整處的直徑2mm大小的菌絲塊連同培養(yǎng)基，置于新的以小米粉與櫟樹葉汁為 培養(yǎng)基的試管中部，使用棉塞常規(guī)斜面培養(yǎng)10~15天，當靈芝菌絲生長至離試管底端3~ 7mm時停止培養(yǎng)，再將試管置于超低溫保藏。此時新的培養(yǎng)基組分為小米粉：櫟樹葉汁= (2.6~3.5):1，培養(yǎng)基組分優(yōu)選為小米粉:櫟樹葉汁=3:1。
[0028] (3)第三次培養(yǎng):選用步驟(2)培養(yǎng)的靈芝菌種試管，取距離試管底端3~10mm、靈 芝菌絲濃密規(guī)整處的直徑2mm大小的菌絲塊連同培養(yǎng)基，置于新的以小米粉與櫟樹葉粉為 培養(yǎng)基的試管中部，使用棉塞常規(guī)斜面培養(yǎng)10~15天，當靈芝菌絲生長至離試管底端3~ 7mm時停止培養(yǎng)，再將試管置于超低溫保藏。此時新的培養(yǎng)基組分為小米粉：櫟樹葉粉= (0.5~1.5):1，培養(yǎng)基組分優(yōu)選小米粉:櫟樹葉粉=1:1。
[0029] (4)第四次培養(yǎng):選用步驟(3)第三次培養(yǎng)的靈芝菌種試管，取距離試管底端3~ 10mm、靈芝菌絲濃密規(guī)整處的直徑2mm大小的菌絲塊連同培養(yǎng)基，置于新的以櫟樹葉粉、Vbl 和水為培養(yǎng)基的試管中部，使用棉塞常規(guī)斜面培養(yǎng)13~17天，當靈芝菌絲長滿試管時停止 培養(yǎng)，再將試管置于超低溫保藏。此時新的培養(yǎng)基質量組分為櫟樹葉粉800~1200份、 Vbl0.0 3~0.07份、水1300~1700份;培養(yǎng)基組分優(yōu)選:櫟樹葉粉1000份、Vbl0.0 5份、水1500 份。
[0030] (5)擴展原種：以櫟樹木肩、麥麩或米糠、黃豆粉、石膏等為培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基質 量組分為櫟樹木肩700~750份、麥麩或米糠 220~280份、黃豆粉15~25份、石膏8~13份、水 1100~1300份，在廣口瓶中接種步驟(4)第四次培養(yǎng)的靈芝菌種，使用棉塞常規(guī)培養(yǎng)18~25 天，當培養(yǎng)發(fā)菌至廣口瓶的一半時換棉塞為四層醫(yī)用紗布封罩瓶口繼續(xù)培養(yǎng)10~20天，當 廣口瓶中菌絲發(fā)滿時停止培養(yǎng)并保藏。
[0031] (6)擴轉生產種：以櫟樹木肩、麥麩或米糠、黃豆粉、石膏等為培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基 質量組分為櫟樹木肩700~750份、麥麩或米糠220~280份、黃豆粉15~25份、石膏8~13份、 水1100~1300份，經蒸汽滅菌、分袋，每袋1.5~1.9kg，于袋身五孔接種步驟(5)培養(yǎng)的靈芝 菌種，并加扎外袋罩護，常規(guī)培養(yǎng);當接種孔發(fā)菌直徑8~10cm后覆膜去外罩護袋，繼續(xù)常規(guī) 培養(yǎng)，當袋物料菌絲發(fā)滿時停止培養(yǎng)并保藏，其中培養(yǎng)期共為30~40天。
[0032] (7)應用生產:將步驟(6)培養(yǎng)的靈芝菌種用于車間規(guī)模化生產。
[0033] 實施例1:
[0034]選取滬農一號赤芝靈芝品種，采用第三代的健壯的靈芝個體組織，分離提取母種， 經上述步驟進行靈芝菌種的提純、復壯及應用于車間規(guī)?；a。其中，第二次培養(yǎng)的培養(yǎng) 基組分為小米粉:櫟樹葉汁=2.6:1;第三次培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分為小米粉:櫟樹葉粉=0.5: 1;第四次培養(yǎng)的培養(yǎng)基質量組分為:櫟樹葉粉用量800份、Vbl用量0.03份、水用量1300份； 擴展原種培養(yǎng)，培養(yǎng)基組分按質量份數計算，櫟樹木肩用量700份、麥麩或米糠用量280份、 黃豆粉用量15份、石膏用量8份、水用量1100份;擴轉生產種培養(yǎng)，培養(yǎng)基組分按質量份數計 算，櫟樹木肩用量750份、麥麩或米糠用量220份、黃豆粉用量20份、石膏用量10份、水用量 1100份;將上一步驟培養(yǎng)的靈芝菌種用于車間規(guī)?；a。重復上述步驟，生產三批次，每 批次車間規(guī)?；a使用柴段木(含水率45%左右）100kg，累計生產出的靈芝及孢子粉總 量為15.45kg、污染報廢量達14.55kg;而對照組，按常規(guī)繼代培養(yǎng)進行車間規(guī)?；a，生 產出的靈芝及孢子粉總量為11.85kg、污染報廢量達100.95kg。
[0035] 實施例2:
[0036]選取滬農一號赤芝靈芝品種，采用第三代的健壯的靈芝個體組織，分離提取母種， 經上述步驟進行靈芝菌種的提純、復壯及應用于車間規(guī)模化生產。其中，第二次培養(yǎng)的培養(yǎng) 基組分為小米粉:櫟樹葉汁=3.5:1;第三次培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分為小米粉:櫟樹葉粉=1.5: 1;第四次培養(yǎng)，培養(yǎng)基質量組分為櫟樹葉粉用量為1200份、Vbl用量為0.07份、水用量為 1700份;擴展原種培養(yǎng)，培