減毒鼠傷寒沙門氏菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及減毒鼠傷寒沙門氏菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是大多數(shù)革蘭氏陰性菌外膜上重要的組成成分，是細(xì)菌重要的毒力因子，就鼠傷寒沙門氏菌而言，完整的LPS對其入侵宿主細(xì)胞，并以沙門小體(Salmonella-containing vacuole(SCV))的形式穩(wěn)定的存在于各類細(xì)胞(如DC細(xì)胞，巨噬細(xì)胞)等起著重要促進(jìn)的作用，它直接關(guān)系到致病菌對宿主的感染能力。CA是一種類似于0抗原的糖單元多聚復(fù)合物，通常只在細(xì)菌遭遇不利條件下，如低溫，低滲，缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，才會被誘發(fā)并大量表達(dá)的，且主要游離地分布在胞外，構(gòu)成b1film的主要成分，對細(xì)菌起保護(hù)支撐的作用，有時可疏松的與細(xì)菌外膜相連接，偶爾可以代替0抗原與lipid A進(jìn)行連接形成一種新的組合物MLPS(XA與沙門氏菌的毒力因子無關(guān)，且免疫源性極低，但有研究表明，CA的缺失有助于減毒沙門氏菌疫苗產(chǎn)生更多的針對其所遞送的外源抗原的免疫性抗體，激發(fā)更好的免疫反應(yīng)，尤其是黏膜免疫，有利于減毒沙門氏菌疫苗的進(jìn)一步開發(fā)。
[0003]—般而言，一株理想的減毒沙門氏菌疫苗或遞送外源抗原的載體應(yīng)該是在減毒的同時保留有與野生株相當(dāng)?shù)牡挚顾拗魑杆帷⒛扄}以及能成功粘附、入侵腸上皮細(xì)胞繼而可定殖于淺層和深層淋巴組織的能力，激發(fā)宿主產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，起到相應(yīng)的免疫保護(hù)作用。
[0004]然而，對于鼠傷寒沙門氏菌而言，LPS中0抗原的生物合成代謝途徑一旦受阻，其毒力會大大減弱，同時減毒菌株對宿主的各類抵抗力將會下降，進(jìn)而嚴(yán)重影響細(xì)菌免疫應(yīng)答水平；因此如何找到能使得所得菌株的免疫應(yīng)答水平不受影響，且減毒效果好的鼠傷害沙門氏菌是一個比較重要且亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一株減毒鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typimurium S116，其特征在于，所述減毒鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typimurium SI 16缺失rfbK和cpsG基因；所述減毒菌株的分類命名為Salmonella typimurium S116，保藏于武漢市武昌珞珈山的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC Μ2015635，保藏時間為:2015年10月23日。
[0006]而本發(fā)明中，所得菌株缺失了rfbK和cpsG基因，其均可產(chǎn)生磷酸甘露糖酶，均可參與到0抗原多聚糖鏈中甘露糖單糖的生物合成，所以，缺失掉rfbK和cpsG基因后，鼠傷寒沙門氏菌的LPS和CA均不能正常合成，細(xì)菌在面對來自宿主機(jī)體的各類抵抗能力更會受到嚴(yán)重影響。但本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)僅需簡單的在體外培養(yǎng)基添加甘露糖，便可以使其體外生長時可正常的合成完整LPS和CA，這樣可在鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行有效減毒的同時，保持了其對宿主的相應(yīng)抵抗力。
[0007]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)摸索，首次發(fā)現(xiàn)了在鼠傷寒沙門氏菌0抗原的生物合成過程中，參與CA合成的cpsG和cpsB基因在功能上可完全互補(bǔ)rfbK和rfbM的基因功能。因此，rfbK和cpsG基因或者rfbM和cpsB基因的同時缺失可完全阻斷沙門氏菌LPS和CA的合成。在早期體外培養(yǎng)階段時額外的添加進(jìn)甘露糖，減毒鼠傷寒沙門氏菌便可利用體外的甘露糖合成完整的LPS和CA，使得細(xì)菌在感染宿主初期具備與野生菌株一樣的抵抗宿主生存壓力的能力。細(xì)菌定殖入宿主機(jī)體以后，由于體內(nèi)甘露糖的缺乏，LPS和CA便不再合成，毒力得到顯著降低。
[0008]因此，本領(lǐng)域人員應(yīng)當(dāng)理解，同時缺失rfbM和cpsB基因的突變株，同樣具有很好的減毒效果。
[0009]本發(fā)明的第二個目的在于提供上述減毒鼠傷寒沙門氏菌的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括如下步驟:
利用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法，將鼠傷寒沙門氏菌細(xì)菌基因組上的rfbK基因和cpsG基因或rfbM基因和cpsB基因敲除，得到不含有rfbK基因和cpsG基因或不含有rfbM基因和cpsB基因的突變株。
[0010]所述自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法包括如下步驟:
(1)構(gòu)建自殺性質(zhì)粒pYA4278-rfbK 或 pYA4278-rfbM;pYA4278-cpsG 或 pYA4278-cpsB;
(2)將步驟(1)所得自殺性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入Apir大腸桿菌，并與鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行自然混合培養(yǎng)，使自殺性質(zhì)粒從大腸桿菌中轉(zhuǎn)移到鼠傷寒沙門氏菌內(nèi)，并與鼠傷寒沙門氏菌基因組中的同源區(qū)域進(jìn)行交叉互配，最終使得整個自殺質(zhì)粒得以整合進(jìn)基因組當(dāng)中，經(jīng)過Cm+抗性篩選，得到第一次同源重組后的陽性克隆菌；
(3)液體LB培養(yǎng)基中(不帶Cm+抗性)繼續(xù)培養(yǎng)陽性克隆菌，使其自發(fā)的發(fā)生第二次同源重組，用含有10%的蔗糖且不含氯化鈉的固體培養(yǎng)基篩選，得到對氯霉素敏感而對蔗糖有抗性的克隆；
(4)通過PCR篩選得到不含rfbK和cpsG基因或不含rf bM和cpsG基因的突變菌株。
[0011 ]所述自殺質(zhì)粒pYA4278-rfbK； pYA4278_cpsG ；pYA4278_rfbM 及pYA4278_cpsB的構(gòu)建步驟如下:
含有rfbK基因上下游同源臂的自殺性質(zhì)粒pYA4278-rf bK的構(gòu)建:
根據(jù)NCBI Genbank公布的鼠傷寒沙門氏菌UK-1全基因組序列，序列號為:CP002614，設(shè)計擴(kuò)增rfbK基因的上游同源臂和下游同源臂的引物序列，運(yùn)用SnapGene軟件設(shè)計下述引物:
DrfbK-lF: 5’ ACAGACGCTTTACTGGTGGC 3’
DrfbK-lR: 5’ CCTCTGACCTTAACTACGTTCATTAGTCC 3’
DrfbK-2F: 5’ ACGTAGTTAAGGTCAGAGGGTGAGGATTA 3’
DrfbK-2R: 5’ AACGCTATCAGAGCCAAATC 3’
提取處于對數(shù)生長期S100基因組DNA作為模板，利用引物DrfbK-lF和DrfbK-lR，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源臂產(chǎn)物，再利用引物DrfbK-2F和DrfbK-2R進(jìn)行擴(kuò)增，得到下游同源臂產(chǎn)物，最后利用引物DrfbK-lF以及DrfbK-2R，以上下游同源臂混合產(chǎn)物為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，得到融合的上下游同源臂擴(kuò)增產(chǎn)物，再利用加A(A堿基)反應(yīng)試劑盒在PCR產(chǎn)物片段末端進(jìn)行加A處理，并與用Ahdl酶切后得到pYA4278酶切產(chǎn)物在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，最后轉(zhuǎn)入Apir大腸桿菌中，得到重組質(zhì)粒pYA4278-rfbK;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入至需要DAP才能生長的Apir大腸桿菌內(nèi)以便進(jìn)行后續(xù)突變株的構(gòu)建；
含有cpsG基因上下游同源臂的自殺性質(zhì)粒pYA4278-cpsG的構(gòu)建:
根據(jù)NCBI Genbank公布的鼠傷寒沙門氏菌UK-1全基因組序列，序列號為:CP002614，設(shè)計擴(kuò)增cpsG基因的上游同源臂和下游同源臂的引物序列，運(yùn)用SnapGene軟件設(shè)計下述引物:
DcpsG-lF: 5’ ACATGCACCGCGAGGTTTAC 3’
DcpsG-lR: 5’ TCTGACGTTATTACCGGGCATAATTGCAGGCG 3’
DcpsG-2F: 5’ GCCCGGTAATAACGTCAGATCTCCCCTTACCG 3’
DcpsG-2R: 5’ GCCAGGTGGCGAGGCGGTTG 3’
提取處于對數(shù)生長期S100基因組DNA作為模板，利用引物DcpsG-lF和DcpsG-lR，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源臂產(chǎn)物，再利用引物DcpsG-2F和DcpsG-2R進(jìn)行擴(kuò)增，得到下游同源臂產(chǎn)物，最后利用引物DcpsG-lF以及DcpsG-2R，以上下游同源臂混合產(chǎn)物為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，得到融合的上下游同源臂擴(kuò)增產(chǎn)物，再利用加A(A堿基)反應(yīng)試劑盒在PCR產(chǎn)物片段末端進(jìn)行加A處理，并與用Ahdl酶切后得到pYA4278酶切產(chǎn)物在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，最后轉(zhuǎn)入Apir大腸桿菌中，得到重組質(zhì)粒pYA4278-CpsG，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入至需要DAP才能生長的Apir大腸桿菌內(nèi)以便進(jìn)行后續(xù)突變株的構(gòu)建。
[0012]含有rfbM基因上下游同源臂的自殺性質(zhì)粒pYA4278-rfbM的構(gòu)建:
根據(jù)NCBI Genbank公布的鼠傷寒沙門氏菌UK-1全基因組序列，序列號為:CP002614，設(shè)計擴(kuò)增rfbM基因的上游同源臂和下游同源臂的引物序列，運(yùn)用SnapGene軟件設(shè)計下述引物:
DrfbM-lF: 5’ GCTGCCTATCGCCGTTCCG 3’
DrfbM-lR: 5 ’GGTGCGCCCAATCCAGCCGCCAGCCATAATTACGGGAAGAAAAGACAT 3，
D rfbM-2F: 5'TGGATTGGGCGCACCCGTTCTGGATTTTCGAAGGAGTGGAC 3’
D rfbM-2R: 5’ GGATCGCAGCCTCATCATG 3’
提取處于對數(shù)生長期S100基因組DNA作為模板，利用引物DrfbM-lF和DrfbM-lR，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源臂產(chǎn)物，再利用引物Drf bM-2F和Drf bM-2R進(jìn)行擴(kuò)增，得到下游同源臂產(chǎn)物，最后利用引物DrfbM-lF以及DrfbM-2R，以上下游同源臂混合產(chǎn)物為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，得到融合的上下游同源臂擴(kuò)增產(chǎn)物，再利用加A(A堿基)反應(yīng)試劑盒在PCR產(chǎn)物片段末端進(jìn)行加A處理，并與用Ahdl酶切后得到pYA4278酶切產(chǎn)物在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，最后轉(zhuǎn)入Apir大腸桿菌中，得到重組質(zhì)粒pYA4278-rfbM;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入至需要DAP才能生長的Apir大腸桿菌內(nèi)以便進(jìn)行后續(xù)突變株的構(gòu)建；
含有cpsB因上下游同源臂的自殺性質(zhì)粒pYA4278-cpsB的構(gòu)建:
根據(jù)NCBI Genbank公布的鼠傷寒沙門氏菌UK-1全基因組序列，序列號為:CP002614，設(shè)計擴(kuò)增cpsB基因的上游同源臂和下游同源臂的引物序列，運(yùn)用SnapGene軟件設(shè)計下述引物:
DcpsB-lF: 5’ CGCGGAACGATTACGCGATCG 3’
DcpsB-lR: 5’CGGCTTATCCGTAGGACGTCATCCCCGAATATCTGCAATAAATTGGCG 3’
DcpsB-2F: 5’CGTCCTACGGATAAGCCGCGCCTGCAATTATGCCCGGTAAGC 3’DcpsB-2R: 5’ CGCGCACCAGCTTCATACCG 3’
提取處于對數(shù)生長期S100基因組DNA作為模板，利用引物DcpsB-lF和DcpsB-lR，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游同源臂產(chǎn)物，再利用引物DcpsB-2F和DcpsB-2R進(jìn)行擴(kuò)增，得到下游同源臂產(chǎn)物，最后利用引物DcpsB-lF以及DcpsB-2R，以上下游同源臂混合產(chǎn)物為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，得到融合的上下游同源臂擴(kuò)增產(chǎn)物，再利用加A(A堿基)反應(yīng)試劑盒在PCR產(chǎn)物片段末端進(jìn)行加A處理，并與用Ahdl酶切后得到pYA4278酶切產(chǎn)物在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，最后轉(zhuǎn)入Apir大腸桿菌中，得到重組質(zhì)粒pYA4278-CpsG，將重組質(zhì)