一種具有緩解pfoa毒害功能的植物乳桿菌及其應(yīng)用
【專利說(shuō)明】一種具有緩解PFOA毒害功能的植物乳桿菌及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種具有緩解PF0A毒害功能 的植物乳桿菌及其應(yīng)用，本發(fā)明還涉及所述植物乳桿菌的用途。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 全氟辛酸(Perfluorooctanoate，PFOA)是當(dāng)今世界上最受關(guān)注的一種全氟類有機(jī) 酸，其自身具有優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，還具有較高的疏水疏油的特性，在碳氧化合 物極低的情況下能在其表面使氟化物具有極高的表面活性，是合成聚四氟乙烯化工產(chǎn)品的 重要原料，被人們普遍大量的用于工業(yè)生產(chǎn)和使用的生活消費(fèi)品中。由于具有穩(wěn)定的化學(xué) 性質(zhì)，PF0A在環(huán)境中很難被降解，從而造成其在環(huán)境中長(zhǎng)期穩(wěn)定地存在，而一旦進(jìn)入生物 體，這些化合物就很難被排出體外或者被分解。研究表明，PF0A在人體內(nèi)的半衰期為3.8年。 其進(jìn)入生物體內(nèi)，不易在脂肪中富集，而是更易與蛋白結(jié)合存在于血液、肝臟等組織器官 中。與此同時(shí)，PF0A的高穩(wěn)定性使得其在生物體內(nèi)不斷積累，具有生物富集性以及沿食物鏈 的生物放大效應(yīng)。其所造成的環(huán)境問(wèn)題己遍布全球各處，重多研宄人員將其視為持久性有 機(jī)污染物家族的新成員而對(duì)其進(jìn)行更為深入且全面的研究。毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PF0A具有肝臟 毒性、免疫毒性、生殖毒性、胚胎發(fā)育毒性、致癌性等。肝臟作為動(dòng)物個(gè)體生命活動(dòng)中的重要 器官，其擔(dān)負(fù)機(jī)體主要代謝和解毒功能，同時(shí)肝臟也是PF0A的主要靶器官之一，也是PF0A引 起毒性的一個(gè)重要作用部位。2005年，美國(guó)環(huán)保局科學(xué)顧問(wèn)委員會(huì)根據(jù)有關(guān)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)， 提議PF0A為一種"可疑致癌物質(zhì)"。
[0003] 考慮到PF0A對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康的潛在威脅，包括美國(guó)杜邦公司和瑞士汽巴公 司等知名化工企業(yè)在內(nèi)的所有8家仍在使用PF0A的公司也已同意最遲于2015年停止生產(chǎn)或 使用PF0A。發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)于PF0A的生產(chǎn)和使用的禁令也正在醞釀之中。我國(guó)PF0A的生產(chǎn)和使 用情況則不容樂(lè)觀。中國(guó)氟硅有機(jī)材料協(xié)會(huì)的梅勝放指出，我國(guó)專門生產(chǎn)PF0A的企業(yè)至少 有2家，另有約8家企業(yè)生產(chǎn)氟聚合物，全都使用PF0A作為乳化劑，每年的使用量約為100噸。 PF0A類化合物在全球環(huán)境介質(zhì)中的廣泛存在，可以通過(guò)飲食、呼吸等途徑進(jìn)入到人體和生 物體內(nèi)，對(duì)人體和生物體造成傷害。作為一種新興污染物，PF0A的相關(guān)研究尚處在起步階 段，目前研究主要集中在環(huán)境介質(zhì)中污染狀況的調(diào)查分析及毒性研究，關(guān)于PF0A的治理研 究主要集中在吸附和降解2種方式。而對(duì)于由PF0A中毒引起的各種生理病癥，目前主要研究 其毒性機(jī)理，尚沒(méi)有開(kāi)發(fā)有效的藥物來(lái)治療其帶來(lái)的毒性損傷。但是PF0A的蓄積毒性和中 毒癥狀引起了越來(lái)越多的關(guān)注，因此尋找一種新的干預(yù)或治療方法顯得十分必要。
[0004] 乳酸菌是一類能夠使碳水化合物發(fā)酵并產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱，廣泛存在于自然 發(fā)酵乳制品、發(fā)酵植物食品，如泡菜、酸菜、青貯飼料以及人腸道中。長(zhǎng)期科學(xué)研究結(jié)果表 明，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生 理功能有:防治乳糖不耐癥、恢復(fù)人體腸道內(nèi)菌群平衡維護(hù)人體健康、抗腫瘤和預(yù)防癌癥作 用、控制人體內(nèi)毒素水平、抗氧化作用、保護(hù)肝臟并增強(qiáng)肝臟的解毒等功能。乳酸菌作為一 種食品級(jí)的微生物，不像螯合劑有嚴(yán)重的毒副作用，且已有諸多報(bào)道表明其在體外、體內(nèi)對(duì) 重金屬等污染物具有較好的吸附作用，很有潛力成為具有吸附PFOA，保護(hù)機(jī)體避免PFOA造 成損傷的新型保健食品。因此，篩選出一種對(duì)PF0A具備優(yōu)良耐受和吸附能力以及具有強(qiáng)抗 氧化能力的乳酸菌，并且證明它們?cè)趧?dòng)物模型中具有良好的緩解PF0A毒性損傷作用，同時(shí) 研制這些乳酸菌實(shí)際的用途就顯得十分必要。本發(fā)明試圖進(jìn)一步地挖掘益生菌的功能，開(kāi) 發(fā)具有更高保健價(jià)值的乳酸菌，為利用膳食策略緩解由PF0A導(dǎo)致的中毒效應(yīng)開(kāi)辟出新的途 徑和解決方案。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CCFM738。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007]本發(fā)明涉及一種乳酸菌，利用形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和生理生化特征等微生物學(xué)特 性對(duì)該乳酸菌鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CCFM738，該菌株已于2015年 10月8日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC No. 11471。
[0008] 所述的植物乳桿菌CCFM738具有下述性質(zhì)：
[0009]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2.5環(huán)境下存活良好；
[0010]⑵在體外含有PF0A的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)PF0A有良好的耐受能力；
[0011]⑶在體外含有PF0A的水溶液中孵育，對(duì)PF0A有良好的吸附能力；
[0012]⑷具有緩解PF0A暴露小鼠中毒癥狀，改善PF0A暴露小鼠肝損傷程度的作用。
[0013]所述的植物乳桿菌CCFM738在制備緩解PF0A中毒的藥物組合物與/或發(fā)酵劑中的 應(yīng)用也屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的藥物組合物是由植物乳桿菌CCFM738菌 劑與在藥學(xué)上可接受的載體組成的。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的植物乳桿 菌CCFM738菌劑是將含有所述植物乳桿菌CCFM738的菌液通過(guò)常規(guī)冷凍干燥工藝制備或其 它方法制備所得到的粉劑，它含有1 〇6CFU/g以上的活性植物乳桿菌CCFM738。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在 藥學(xué)上通常使用的填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑的載體。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、 丸劑或口服液劑型。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的發(fā)酵劑是通過(guò)下述制備步驟得到的：
[0018] A、培養(yǎng)基的制備：使用以所述培養(yǎng)基總重量計(jì)87.7 %水將10 %酶水解脫脂乳、 0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨與0.3%酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其pH為6.8,這樣得到所述的 培養(yǎng)基；
[0019] B、保護(hù)劑的制備:使用水與保護(hù)劑原料混合制備得到含有100g/L脫脂奶粉、30mL/ L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸鈉的保護(hù)劑；
[0020]C、將植物乳桿菌CCFM738菌種按照以所述培養(yǎng)基的重量計(jì)2-4%接種量接種到在 溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述培養(yǎng)基中，在溫度37°C下培養(yǎng)18h，用pH7.2磷酸鹽緩 沖液清洗2-4次，用所述保護(hù)劑重懸達(dá)到濃度101()CFU/ml;接著，讓該懸浮液在溫度37°C下預(yù) 培養(yǎng)60min，再進(jìn)行冷凍干燥得到所述的發(fā)酵劑。
[0021 ]下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)CCFM738，該菌株已于 2015年10月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，分類學(xué)命名為植 物乳桿菌Lactobacillusplantarum，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編 號(hào)為CGMCCNo.11471。
[0023] 本發(fā)明人根據(jù)下述篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)大量篩選實(shí)驗(yàn)與分析驗(yàn)證，從我國(guó)傳統(tǒng)食品，例 如泡菜，發(fā)酵奶酒中篩選出的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM738具有下述性 質(zhì)：
[0024]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2.5環(huán)境下存活良好；
[0025]⑵在體外含有PF0A的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)PF0A有較好的耐受能力；
[0026]⑶在體外含有PF0A的水溶液中孵育，對(duì)PF0A有良好的吸附能力；
[0027]⑷具有緩解PF0A暴露小鼠中毒癥狀，改善PF0A暴露小鼠肝損傷程度的作用。
[0028]下面將詳細(xì)描述這些實(shí)驗(yàn)與分析認(rèn)證結(jié)果。
[0029] 1、具有耐酸性，在pH3.0-9.0環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2.5環(huán)境下存活良好
[0030]將冷凍保存的本發(fā)明植物乳桿菌CCFM738接種于MRS培養(yǎng)基(例如青島海博生物技 術(shù)有限公司的產(chǎn)品）中，在溫度37°C下培養(yǎng)18h，再經(jīng)MRS培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)2~3次后，以1 %的 接種量分別接種于不同pH值(3.0-9.0)的MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37°C下培養(yǎng)18h，測(cè)定初 始和培養(yǎng)結(jié)束后的〇D6QQ值，利用這個(gè)值測(cè)量在細(xì)菌培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度，從而估計(jì)細(xì)菌的 生長(zhǎng)情況。OD600值是采用分光光度法在波長(zhǎng)600nm處測(cè)定的細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光值，它通常用 于表示在細(xì)菌培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度，以確定液體培養(yǎng)物中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。
[0031] 試驗(yàn)結(jié)果證明植物乳桿菌CCFM738在PH3.0-9.0的環(huán)境中生長(zhǎng)良好，因此得以進(jìn)行 后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用與前面所述的同樣培養(yǎng)方式，用l.OmLpH7.2PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗菌體 兩次，再用l.OmLpH7.2磷酸鹽緩沖液重懸，其重懸乳桿菌菌體與9.OmLpH2.5人工胃液混 合，然后在溫度37°C下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在開(kāi)始(Oh)和3h時(shí)取樣，用MRS瓊脂培養(yǎng)基澆注培養(yǎng) 進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定活菌數(shù)并計(jì)算其存活率。存活率是在該培養(yǎng)液中在第3h時(shí)的活菌 數(shù)對(duì)數(shù)值與在第〇h時(shí)活菌數(shù)對(duì)數(shù)值之比，以％表示。本發(fā)明篩選存活率在80 %以上的菌株 進(jìn)行后續(xù)研究。
[0032] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌CCFM738在pH2.5的人工胃液環(huán)境中的存活率在90%以 上。由此可見(jiàn)，植物乳桿菌CCFM738具有耐酸性，在pH2.5的環(huán)境下存活良好。
[0033] 2、在體外含PF0A的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)PF0A具有良好的耐受能力 [0034] 植物乳桿菌CCFM738對(duì)PF0A耐受能力通過(guò)最低抑制濃度（MIC)方法測(cè)定。配制 100mg/L的PF0A溶液作為PF0A的母液，并用孔徑大小為0.22μπι的無(wú)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。將除 菌