一種能夠緩解羅非魚鉛毒性的植物乳桿菌飼料的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種能夠緩解羅非魚鉛毒性的植物乳桿菌飼料，屬于飼料技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鉛是自然界中很常見的一種重金屬元素，對人體有很強(qiáng)的毒性。1993年世界衛(wèi)生 組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FA0/WH0)聯(lián)合法典委員會推薦的人體可耐受鉛攝入量為25 μ g/ (kg ·體重?周）。金屬鉛質(zhì)地柔軟，是人類最早應(yīng)用的金屬之一，它的主要用途是制作鉛 蓄電池，在汽油抗爆劑、建筑、金屬加工材料、軍火、彩色電視顯像管及輻射屏蔽等方面應(yīng)用 廣泛。因為鉛酸蓄電池提供能量保存，軍用和民用生產(chǎn)生活都離不開它。隨著經(jīng)濟(jì)社會的 往前進(jìn)步，尤其是工業(yè)化的加速前進(jìn)，鉛污染的問題日益突出，水環(huán)境的鉛污染也越來越嚴(yán) 峻。有報道，進(jìn)十年來，隨著中國一直前進(jìn)的工業(yè)化，觸及鉛污染的產(chǎn)業(yè)也越來越多，包括重 金屬開采、金屬冶煉、化工、印染、能源等，還有一些違規(guī)企業(yè)的濫開采、違法排污等問題突 出，鉛污染事故的發(fā)生也是越來越頻繁。由于鉛污染的特性，大量的鉛進(jìn)入水產(chǎn)養(yǎng)殖水體， 對水生生物造成了毒害，并產(chǎn)生急性、慢性病害，對水產(chǎn)品的使用安全性造成威脅，嚴(yán)重影 響了漁業(yè)生產(chǎn)及水環(huán)境的生態(tài)平衡，進(jìn)而對人類健康造成危害。
[0003] 鉛對動物的毒理學(xué)研究已經(jīng)開展了幾十年，研究表明鉛中毒可對機(jī)體內(nèi)各個系統(tǒng) 造成不同程度的損傷。重金屬鉛進(jìn)入水生生物體內(nèi)后，會造成蓄積，同時對其健康造成消極 的影響，幾乎毒害身體中所有的器官，影響正常的生理功能，并有潛在的致畸、致突變危害， 形成慢性或者是急性中毒癥狀，嚴(yán)重時可能會導(dǎo)致水生生的死亡率上升。目前的研究發(fā)現(xiàn) 鉛中毒對水生生物的毒害作用主要體現(xiàn)在以下幾個方面:A，影響免疫系統(tǒng)；B，損害造血系 統(tǒng)；C，影響內(nèi)分泌系統(tǒng)；D，損害生殖系統(tǒng)。
[0004] 水生動物鉛中毒的治療研究較少，其主要思路是吸附鉛或者是緩解鉛造成的毒害 作用。當(dāng)前研究對水生生物的鉛中毒治療方法主要是在飼料中添加一定抗氧化劑或者是鉛 吸附劑?？寡趸瘎┲饕且恍┚S生素及抗氧化物質(zhì)包括維生素 A、維生素 C、維生素 E、硫胺 素以及礦物質(zhì)硒，鉛吸附劑的研究在蒙脫土、泡沸石和凹凸棒土上有所涉及。而抗氧化劑使 用成本較高，吸附劑使用可能會破壞水生生物體內(nèi)的離子平衡。
[0005] 鑒于當(dāng)前的研究現(xiàn)狀以及治療方法的有限性，針對水生生物的鉛蓄積和鉛中毒探 索一種新的干預(yù)或治療方法顯得十分必要；而上述幾種治療方法的可行性也促使我們繼續(xù) 尋找應(yīng)用更廣泛、潛力更巨大，同時又具有緩解鉛毒性作用的手段。益生菌廣泛存在于人類 腸道、自然發(fā)酵乳制品以及植物性發(fā)酵食品如泡菜、酸菜之中。長期科學(xué)研究結(jié)果表明，益 生菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有：防治乳糖不耐 癥、恢復(fù)人體腸道內(nèi)菌群平衡維護(hù)人體健康、抗腫瘤和預(yù)防癌癥作用、控制人體內(nèi)毒素水平 等功能。有研究者已經(jīng)證實，某些特定菌株的乳酸菌能夠有效的吸附重金屬離子，且在緩解 氧化應(yīng)激與氧化損傷有顯著的作用。乳酸菌作為微生物有成本低、無環(huán)境危害、可作為飼料 添加劑等特點。而且，已經(jīng)有大量學(xué)者研究了益生菌飼料對水產(chǎn)動物的益生作用，但在緩解 水生生物鉛中毒方面未有人報道。因此探索一種能夠緩解水生動物鉛中毒的益生菌飼料， 其實踐意義巨大。因此探索研究一種緩解鉛毒性的乳酸菌飼料就可以進(jìn)一步的挖掘益生菌 的功能，開發(fā)具有更高價值的益生菌，為利用益生菌添加劑緩解水生動物鉛毒性開辟出新 的途徑和解決方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種植物乳桿菌飼料，所述植物乳桿菌飼料是將植物乳桿菌 CGMCC No. 5494以飼料添加劑的形式加入到水生動物飼料的預(yù)混料中進(jìn)行制?；蛘呤穷A(yù)先 制粒后進(jìn)行以載體噴涂益生菌的方式制備含活菌的益生菌飼料，所述植物乳桿菌飼料中含 有活菌含量大于l〇sCFU/g的植物乳桿菌CGMCC No. 5494。
[0007] 所述植物乳桿菌CGMCC No. 5494于2011年11月29日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院 微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 5494。
[0008] 所涉及的植物乳桿菌CGMCC No. 5494具有以下生物學(xué)特性：
[0009] (1)菌體特征：革蘭氏染色陽性，細(xì)胞呈短桿狀，菌體約0.5-1. Ομπι寬，2-4 μπι長， 成單、成對或者成鏈，不形成芽孢，兩端圓形；
[0010] (2)菌落特征：在MRS培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，直徑在0. 3-2. 0mm之間，圓形，乳 白色，半透明，表面濕潤光滑，邊緣整齊，不產(chǎn)生色素；
[0011] (3)生長特性：該菌株的最低生長溫度為20°C，最高生長溫度為40°C，在溫度 30-37°C下生長最佳，能耐受的最高和最低初始生長pH為9. 0和2. 5,最適生長初始pH為 6. 0 ;本發(fā)明植物乳桿菌菌株的延遲期相對較短，4h左右開始進(jìn)入對數(shù)生長期，12h就達(dá)到 穩(wěn)定期。
[0012] 所涉及的植物乳桿菌CGMCC No. 5494作為飼料添加劑加入到水生動物飼料中，還 具有下述有益特性：
[0013] (1)能提高羅非魚的生長速率；
[0014] (2)能提高鉛暴露羅非魚的腸道消化酶活力；
[0015] (3)能降低鉛暴露羅非魚體內(nèi)鉛含量，尤其是羅非魚肝胰臟、腎臟、脾臟和鰓的鉛 含量；
[0016] (4)能緩解鉛暴露羅非魚體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷；
[0017] (5)能提高鉛暴露羅非魚體內(nèi)氨基乙酰丙酸脫水酶（ALAD)的活性；
[0018] (6)能提高鉛暴露羅非魚的溶菌酶活性與髓過氧化物酶活性（ΜΡ0);
[0019] (7)能緩解鉛暴露羅非魚的細(xì)胞和遺傳毒性。
[0020] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述飼料添加劑是CGMCC No. 5494的濃縮菌液或者 是冷凍干燥工藝獲得的凍干菌粉，或是CGMCC No. 5494的海藻酸鈉微膠囊菌劑。
[0021] 所述載體是在飼料中可接受的載體。
[0022] 所述在飼料中可接受的載體是一種或多種在飼料中通常使用的粘合劑、潤滑劑或 者是保護(hù)劑。
[0023] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述濃縮菌液的制備包括以下步驟：
[0024] A.培養(yǎng)基的制備：使用以按培養(yǎng)基總質(zhì)量計87. 7%的水將10 %酶水解脫脂乳、 0. 5%葡萄糖、1. 5%胰蛋白胨與0. 3%酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其pH為6. 8,得到培養(yǎng)基；
[0025] B.植物乳桿菌CGMCC 5494菌種按照以所述培養(yǎng)基的質(zhì)量計2-4%的接種量接種 到在溫度110_120°C下滅菌8-12min后的培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C下培養(yǎng)18h，用pH7. 2 磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用生理鹽水重懸使活菌濃度達(dá)到10nCFU/mL，得到新鮮濃縮菌 液。
[0026] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述凍干菌粉的制備包括以下步驟：
[0027] C.冷凍干燥保護(hù)劑的制備：使用水與保護(hù)劑原料混合制備得到含有100g/L脫脂 奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸鈉的保護(hù)劑；
[0028] D.按照步驟A、B的做法磷酸鹽緩沖液清洗2-4次后用步驟C準(zhǔn)備的冷凍干燥保 護(hù)劑重懸使活菌濃度達(dá)到10nCFU/mL，讓該懸浮液在溫度37°C下預(yù)培養(yǎng)60min，再進(jìn)行冷凍 干燥得到所述的凍干菌粉。
[0029] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述的海藻酸鈉微膠囊菌劑的制備包括以下幾個步 驟：
[0030] E.將CGMCC 5494的活菌濃度達(dá)到10nCFU/mL以上的濃縮菌液，以體積比為1:10 與2%海藻酸鈉溶液充分混合，并加入0. 4%的吐溫80,磁力攪拌器攪拌乳化15min，使用壓 力噴嘴噴入〇. 2mol/L的CaC12溶液中，固化15min，用紗布過濾，生理鹽水沖洗三次，得到海 藻酸鈉微膠囊菌劑。
[0031] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述的羅非魚基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成如下表1、表 2所示：
[0032] 表1基礎(chǔ)飼料組成及含量
[0034] 注：a預(yù)混料為每千克飼料提供：維生素 A，3000IU ;維生素 D，1500IU ;維生素 E， 150mg ;維生素 K，15mg ;維生素隊，10mg ;維生素 B2,20mg ;維生素 B6,10mg ;維生素 Β12,0· lmg ; 維生素 C，500mg ;泛酸媽，20mg ;煙酸，25mg ;葉酸，5mg ;肌醇，