一種醋酸可的松催化反應(yīng)中環(huán)糊精介質(zhì)的循環(huán)利用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及醋酸可的松生物催化中環(huán)糊精介質(zhì)的循 環(huán)利用技術(shù)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 甾體底物的低水溶性使得甾體底物與酶的有效接觸非常困難，嚴(yán)重制約著甾體轉(zhuǎn) 化反應(yīng)的速度和產(chǎn)率，環(huán)糊精外環(huán)親水，內(nèi)環(huán)親脂的特殊結(jié)構(gòu)使其能作為超分子主體化合 物包結(jié)疏水性底物，從而提高底物的溶解度。環(huán)糊精與客體形成的包結(jié)物能對微生物具有 較好的生物相容性，這種性質(zhì)推動(dòng)其在醋酸可的松的微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域得到廣泛的研究。隨 著環(huán)糊精及其衍生物在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的應(yīng)用，環(huán)糊精在生物轉(zhuǎn)化方面的作用已相當(dāng)明顯， 應(yīng)用也逐漸成熟，逐步走向工業(yè)生產(chǎn)階段。但是，環(huán)糊精的價(jià)格相對較高限制其在生物催化 技術(shù)中的應(yīng)用。在環(huán)糊精體系中，如何實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精介質(zhì)的循環(huán)利用，是環(huán)糊精類介質(zhì)在工業(yè) 應(yīng)用中亟待解決的重要科學(xué)和技術(shù)問題。
[0003] 雙金玲等在《纖維素固載β-環(huán)糊精的研究進(jìn)展》（《纖維素科學(xué)與技術(shù)》2007年 12月，15(4))中指出，將環(huán)糊精與高分子機(jī)制連接起來，形成固化環(huán)糊精材料，既保留了環(huán) 糊精的獨(dú)特性質(zhì)，又具有高分子材料的特征如良好的機(jī)械性能、穩(wěn)定性和化學(xué)可調(diào)性，這給 環(huán)糊精的應(yīng)用提供了更廣闊的空間。而纖維素作為自然界中儲(chǔ)量最豐富的天然高分子具有 很多優(yōu)勢，將纖維素和環(huán)糊精這兩種環(huán)境友好材料通過適當(dāng)?shù)姆椒ńY(jié)合起來，制備出特殊 性能的材料，將在環(huán)境保護(hù)、食品、包裝、醫(yī)療、日化等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。而目前，纖維素 固載環(huán)糊精已經(jīng)在纖維紡織工業(yè)、污水處理、醫(yī)療保健、空氣凈化等方面。
[0004] 中國專利CN102352557Α公布了一種環(huán)糊精固載醋酸纖維素的方法及應(yīng)用。所述 方法包括以下步驟：a、醋酸纖維素改性整理液的配制；b、浸乳工藝；c、烘培工藝；d、水洗除 雜；e、干燥。利用本方法制備出的環(huán)糊精接枝固載醋酸纖維素可應(yīng)用于卷煙濾嘴材料上，可 降低卷煙主流煙氣中苯及苯系物、揮發(fā)性酚類化合物、多環(huán)芳烴以及重金屬等有害成分，或 提高卷煙醋酸纖維絲束的染色穩(wěn)定性和可染性，或延長卷煙濾嘴留香以及香氣的緩釋。本 發(fā)明采用檸檬酸作為交聯(lián)劑，首次將環(huán)糊精接枝于醋酸纖維素上，采用的檸檬酸為常用的 食品添加劑，具有更好的安全性；對于卷煙生產(chǎn)廠家而言，采用具有選擇性減害效果的改性 醋酸纖維濾嘴，不需要另購置昂貴的復(fù)合成型機(jī)，可降低成本，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
[0005] 絲瓜絡(luò)作為植物載體，不僅可以增加細(xì)胞的穩(wěn)定性，還能保持菌體的活性。其結(jié)構(gòu) 中含有大量的纖維素，能以環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑與環(huán)糊精進(jìn)行接枝，形成固載化的環(huán)糊精 高分子材料。這樣既可以保留環(huán)糊精的獨(dú)特性質(zhì)，又具有高分子材料的特性。
[0006] 但是目前關(guān)于以絲瓜絡(luò)作為載體，以纖維素固載環(huán)糊精的形式作為促溶劑運(yùn)用于 難溶化合物的生物轉(zhuǎn)化，并對環(huán)糊精進(jìn)行循環(huán)利用的技術(shù)尚未可見。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明提供一種醋酸可的松生物催化中環(huán)糊精介質(zhì)的循環(huán)利用方法，具體如下： 在醋酸可的松的生物催化體系中，以接枝絲瓜絡(luò)的環(huán)糊精為促溶劑，反應(yīng)結(jié)束后，將接枝環(huán) 糊精的絲瓜絡(luò)取出，使用緩沖液洗滌絲瓜絡(luò)2-5次并烘干后重新用于醋酸可的松的生物催 化，從而實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精介質(zhì)的循環(huán)利用；
[0008] 所述接枝環(huán)糊精的絲瓜絡(luò)可在不補(bǔ)加環(huán)糊精的條件下循環(huán)使用8次以上；
[0009] 所述緩沖液為磷酸鹽緩沖溶液，ρΗ7· 2 ;
[0010] 所述緩沖液的用量為每次每克絲瓜絡(luò)60-100ml;
[0011] 所述烘干的溫度為50°C-80°C;
[0012] 所述接枝絲瓜絡(luò)的環(huán)糊精的制備方法如下：
[0013] (1)溶脹：將絲瓜絡(luò)置于蒸餾水中，并加入其干重5-8倍的0.lmol/L的氫氧化鈉 溶液中溶脹l_3h;
[0014] (2)環(huán)氧化：將溶脹后的絲瓜絡(luò)置于蒸餾水中，并按絲瓜絡(luò)干重與環(huán)氧氯丙烷按 重量比為1 :6-1:20將加入環(huán)氧氯丙烷、以及絲瓜絡(luò)干重2倍的10!11〇1/1似0!1溶液進(jìn)行環(huán) 氧化，在45-60 °C下反應(yīng)3-6h;
[0015] (3)接枝：將環(huán)氧化絲瓜絡(luò)先后用蒸餾水和丙酮清洗、烘干后投入到其重量40-70 倍的濃度為l〇mol/L的氫氧化鈉溶液中，再加入環(huán)氧化絲瓜絡(luò)干重0. 9-2. 0倍的環(huán)糊精，在 40-60°C下進(jìn)行接枝反應(yīng)3-6h;
[0016] (4)洗滌：反應(yīng)完畢后用蒸餾水洗滌絲瓜絡(luò)至洗出液為中性，烘干即得接枝絲瓜 絡(luò)的環(huán)糊精；
[0017] 所述的環(huán)糊精為α-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、羧 甲基-β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、羥乙基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精、磺酸 基-β-環(huán)糊精等水溶性的環(huán)糊精。
[0018] 有益效果：
[0019] (1)本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精介質(zhì)循環(huán)利用，在循環(huán)8次后底物醋酸可的松轉(zhuǎn)化率 仍可以達(dá)到90%以上，達(dá)到提高留體等醋酸可的松催化反應(yīng)效率的同時(shí)降低生產(chǎn)成本的目 的，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。
[0020] (2)本發(fā)明可以提高醋酸可的松生物催化初始轉(zhuǎn)化速率2. 5倍左右，最終轉(zhuǎn)化率 提尚2%〇
[0021] (3)本發(fā)明所述的環(huán)糊精循環(huán)利用工藝方法簡單便捷，便于實(shí)現(xiàn)，成本節(jié)約。
【附圖說明】：
[0022] 圖1接枝后β-環(huán)糊精循環(huán)利用8次中醋酸可的松轉(zhuǎn)化率變化情況
【具體實(shí)施方式】：
[0023] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 實(shí)施例1 :化合物醋酸可的松的Cli2位脫氫反應(yīng)
[0025] 微生物菌種采用簡單節(jié)桿菌ArthrobactersimplexTCCC11037,它能實(shí)現(xiàn)甾體 化合物的(；，2位脫氫轉(zhuǎn)化，將醋酸可的松（CA)轉(zhuǎn)化為醋酸潑尼松；
[0026] 斜面培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖10,酵母膏10,瓊脂20,pH7. 2
[0027]種子培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖10,玉米漿10,蛋白胨5,磷酸氫二鉀2. 5,pH7. 2
[0028] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖10,玉米漿15,蛋白胨5,磷酸氫二鉀2. 5,pH7. 2
[0029] 簡單節(jié)桿菌菌體制備：
[0030] 微生物在32°C，160r/min，30/250mL裝量條件下活化培養(yǎng)18h，取活化種子以1:20 比例在裝量為30/250mL條件下培養(yǎng)20h，將發(fā)酵培養(yǎng)獲得的細(xì)胞5000r/min離心后用pH 7. 2的磷酸緩沖液（PBS)洗滌三遍，重懸于pH7. 2的PBS緩沖液中的簡單節(jié)桿菌靜息細(xì)胞 菌懸液；
[0031] β-環(huán)糊精與絲瓜絡(luò)的接枝：
[0032] 稱取lg市售普通絲瓜絡(luò)，放入250ml錐形瓶中，并加入25ml蒸餾水和0.lmol/L 的氫氧化鈉溶液5g，溶脹lh。將溶脹后的絲瓜絡(luò)取出洗凈，于250mL三角瓶中放入155mL 水，加入與絲瓜絡(luò)重量比1:20的環(huán)氧氯丙烷，再加入與絲瓜絡(luò)重量比1:2的10mol/LNaOH 溶液，45°C恒溫反應(yīng)3h，反應(yīng)完畢后取出，水洗至不含環(huán)氧氯丙烷為止，再用丙酮清洗兩遍， 50°C烘干備用。將制備的環(huán)氧化絲瓜絡(luò)，放入10m〇l/L的NaOH與β-環(huán)糊精的混合溶液中， 環(huán)氧化絲瓜絡(luò)與NaOH的質(zhì)量比為1:40,環(huán)氧化絲瓜絡(luò)與β-環(huán)糊精的質(zhì)量比為1:1. 3,放 入恒溫水浴鍋中，40 °C振蕩反應(yīng)3h。停止震蕩，并向燒杯中加入適量蒸餾水洗滌，抽濾至洗 出液為中性，50°C烘干備用。
[0033] 生物轉(zhuǎn)化：
[0034] 取3mL靜息細(xì)胞菌懸液，加入17mL的PBS(pH7. 2)和0.06g的CA于100mL三角 瓶中，再加入0. 3g接枝環(huán)糊精的絲瓜絡(luò)（接枝的β-環(huán)糊精量為0. 019g)，對照組加入沒有 接枝絲瓜絡(luò)的環(huán)糊精0. 〇19g，34°C、180r/min轉(zhuǎn)化8h，HPLC法測定底物轉(zhuǎn)化率；
[0035] 環(huán)糊精的循環(huán)利用工藝：
[0036] 將環(huán)糊精與絲瓜絡(luò)接枝后用于上述CA的生物催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集接枝環(huán) 糊精的絲瓜絡(luò)，將其用PBS(pH7. 2)洗滌3次，緩沖液的用量為每次每克絲瓜絡(luò)80ml，于 50°C烘箱中烘干，重新用于醋酸可的松的生物轉(zhuǎn)化，用量不變。
[0037] 結(jié)果表明，對照組的轉(zhuǎn)化率為93%，接枝β-環(huán)糊精的絲瓜絡(luò)的初次轉(zhuǎn)化率是 94%，且初始轉(zhuǎn)化速率為對照組的2. 5倍，循環(huán)利用8次后，CA的最終轉(zhuǎn)化率為92%，見表 1〇
[0038] 表 1
[0039]
[0040] 實(shí)施案例2 :
[0041] 除以下內(nèi)容外，其他同實(shí)施例1。
[0042] 環(huán)糊精與絲瓜絡(luò)的接枝：
[0043] 稱取lg市售普通絲瓜絡(luò)，放入250ml錐形瓶