專利名稱：豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗的方法，可用于工
業(yè)化生產(chǎn)豬流行腹瀉疫苗，替代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)豬流行性腹瀉疫苗生產(chǎn)唯一依靠細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法實(shí)現(xiàn)。該傳統(tǒng)工藝勞 動(dòng)強(qiáng)度大，耗時(shí)長、效率低，生產(chǎn)成本高；容易被環(huán)境污染；不同生產(chǎn)批次間或同一生產(chǎn)批 次不同瓶間的差異大；難以擴(kuò)大生產(chǎn)；容易出現(xiàn)被細(xì)菌或其它病毒污染而致的疫苗質(zhì)量隱 患，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法技術(shù)存在的不足之處，提供一種應(yīng)用 生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)高效生產(chǎn)豬流行性腹瀉疫苗的方法。該方法可以大量降低生產(chǎn) 成本，而且生產(chǎn)周期短，占用場(chǎng)地小，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，環(huán)境污染少且易于處理，自動(dòng) 化程度高，用人少，質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定。可顯著提高豬流行性腹瀉病毒的單位效價(jià)以及 疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了如下的技術(shù)方案
—種豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法，包括如下步驟 (1)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)取IB-RS-2細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳 代，以"細(xì)胞生長液"培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35-38t:;形成良好細(xì)胞單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種 于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)； (2)細(xì)胞毒種的繁殖用"病毒培養(yǎng)液"將豬流行腹瀉病毒種毒按0. 5-5%比例 接種到步驟(1)形成的良好細(xì)胞單層繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞50-100%以上病變時(shí)收獲病毒液； 再將此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代復(fù)壯，每次傳代產(chǎn)物進(jìn)行病毒 TCID5。和無菌檢測(cè)，傳至病毒TCID5。穩(wěn)定且達(dá)到107 5TCID5。/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，作為生產(chǎn) 種子； (3) IB-RS-2細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器按總體積的 30% -80%加入無菌"細(xì)胞生長液"，且每升無菌細(xì)胞生長液中按3-10g/L濃度加入微載體， 啟動(dòng)生物反應(yīng)器，低轉(zhuǎn)速攪拌30分鐘后，取步驟(1)轉(zhuǎn)瓶上生長良好的IB-RS-2細(xì)胞，經(jīng) EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按按1 3X 105個(gè)/mL的密度接 種到反應(yīng)器中，設(shè)定適合的溫度、PH、攪拌速度、溶氧含量等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制 培養(yǎng)。 (4)制苗毒液的繁殖待觀察微載體上細(xì)胞長滿80% _90%，空球率低于5%，，滿 球率大于80 % ，細(xì)胞狀態(tài)良好，且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)到1 3 X 106個(gè)/mL以上進(jìn)行接毒操作， 按O. 5-5%比例接入步驟(2)制備好的豬流行性腹瀉病毒種毒，設(shè)定適合的溫度、PH、攪拌 速度、溶氧含量等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)；按0. 1_5%的比例接入豬流行腹瀉病毒種毒毒液，接毒后每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測(cè)樣品的TCID5。；待觀察微載體上細(xì)胞基本全部脫落，且D0值呈明顯上升趨勢(shì)，停止反應(yīng)器攪拌，待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后，收獲上清液和微載體； (5)收獲病毒液的處理病毒液和微載體經(jīng)1次凍融后，離心或過濾去除細(xì)胞碎片后-2(TC冷凍保存?zhèn)溆谩?上述技術(shù)方案中，生物反應(yīng)器為能夠自動(dòng)控制溫度、PH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，容積為3L-3000L。 上述技術(shù)方案中，微載體為Cytodex系列微載體，微載體在使用前需清洗、滅菌，方法如下1)用PBS浸泡微載體三小時(shí)以上；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微
載體，12rc蒸汽滅菌三十分鐘。 上述技術(shù)方案中，"EDTA-胰酶細(xì)胞分散液"配方為質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是0. 25%的胰酶(1 : 250) 、0. 02%的EDTA的Hank' s液； 上述技術(shù)方案中，"細(xì)胞生長液"的配方為質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是90% -98% MEM液、2% _10%牛血清、終濃度為100-200IU/mL的抗菌素，PH為6. 8_7. 6。
上述技術(shù)方案中，種毒接種量為0. 5-5%， 上述技術(shù)方案中，"病毒培養(yǎng)液"配方為含血清l-4X的MEM液、終濃度為100-200IU/mL的抗菌素，PH調(diào)整為7. 2_7. 4。 上述技術(shù)方案中，生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度33-38 °C、PH6. 5-7. 68、溶氧30% _70%、攪拌速度30-80rpm。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果 (1)用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)代替轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制造豬流行性腹瀉疫苗，可解決生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、病毒效價(jià)低的問題，通過生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)工藝的改變，提高病毒單位培養(yǎng)效價(jià)5-10倍，全面提升疫苗質(zhì)量和產(chǎn)量，提高疫苗的安全性。
(2)本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，而且生產(chǎn)周期短，每個(gè)生產(chǎn)周期僅需5-6天，相比現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法的6-7天以上明顯縮短。 (3)應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，具有自動(dòng)化程度高，用人少，生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定。易操作、產(chǎn)量大占用場(chǎng)地小，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定。
(4)應(yīng)用本方法生產(chǎn)疫苗，產(chǎn)品病毒效價(jià)比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法提高5-10倍，成本降低3-4倍。產(chǎn)品質(zhì)量均一，易于規(guī)模化生產(chǎn)，整個(gè)生產(chǎn)工藝過程不涉及傳統(tǒng)生產(chǎn)方法所具有的其他生物安全和公共衛(wèi)生問題。


圖1為本發(fā)明的制備流程圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合說明書附圖及具體實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
(1)選擇生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)的手段75L生物反應(yīng)器。 (2)選擇微載體作為細(xì)胞貼附生長的載體微載體Cytodex-3 (3)微載體的清洗、滅菌方法1)稱量Cytodex-2微載體3g/L、使用2LPBS液浸泡三小時(shí)。2)每次用2L PBS液清洗3遍。3)加入2L PBS液浸泡微載體，12rC蒸汽滅菌三十分鐘。 (4)選擇IB-RS-2細(xì)胞作為制苗用細(xì)胞 (5)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)上述細(xì)胞經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液(含0. 25%胰酶(規(guī)格為1 : 250) 、0. 02% EDTA的Hank' s液)消化傳代，以含92% MEM液、8X小牛血清、200IU/ml的青霉素鈉和硫酸鏈霉素，K1調(diào)整為7. 4的細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C。形成良好單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)。
(6)細(xì)胞毒種的繁殖用細(xì)胞維持液，將來豬流行性腹瀉病毒種毒按2%比例接種生長良好的上述細(xì)胞單層，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為33°C。至細(xì)胞80%以上病變時(shí)收獲病毒液；測(cè)定病毒的TCIDs。，待病毒效價(jià)穩(wěn)定且達(dá)到107 5TCID5。/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，將該病毒作為生產(chǎn)用種毒。 (7)IB-RS-2細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng)取轉(zhuǎn)瓶上生長良好的IB-RS-2細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)密度按1 X 105/ml接種反應(yīng)器中。生物反應(yīng)器設(shè)定如下參數(shù)溫度37t:、PH7. 2、攪拌速度60rpm、溶氧含量50X進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)。 (8)制苗毒液的繁殖培養(yǎng)后第三日待觀察微載體上細(xì)胞基本長滿，且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)2X 107ml以上后進(jìn)行接毒操作。設(shè)定溫度34°C、PH7. 8、攪拌速度70rpm、溶氧含量30%等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)。接毒后每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測(cè)樣品的TCID5。。待觀察微載體上細(xì)胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢(shì)，停止反應(yīng)器攪拌，待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后，分別收獲上清液和微載體。 收獲病毒液的處理經(jīng)1次反復(fù)凍融后，過濾去除細(xì)胞碎片后_201:冷凍保存?zhèn)溆谩?半成品檢驗(yàn)及疫苗制造、成品檢驗(yàn) 1.收獲病毒液毒價(jià)的測(cè)定將以上收獲的細(xì)胞病毒液混合后取樣，測(cè)定毒價(jià)。病毒含量應(yīng)^ 107 5ELD5。/ml。 滅活按總量的0. 2%向病毒液中加入甲醛溶液，振搖2分鐘，置37t:條件滅活24小時(shí)。期間定時(shí)攪拌混勻。
2.滅活后半成品檢驗(yàn) 無菌檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》附錄301頁進(jìn)行，無菌生長。
滅活檢驗(yàn)滅活后，以無菌操作從病毒滅活液中取樣，按1%比例接種健康IB-RS-2細(xì)胞單層，37t:培養(yǎng)3天，按此方法，連續(xù)傳代3代，細(xì)胞不應(yīng)出現(xiàn)病變?yōu)楹细瘛?br> 3.疫苗制造和成品檢驗(yàn)按《豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗制造和檢驗(yàn)規(guī)程》要求進(jìn)行。
權(quán)利要求
一種豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于選擇生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)工具；選擇微載體作為細(xì)胞貼附的生長載體；選擇IB-RS-2細(xì)胞作為制苗用細(xì)胞系；并包括如下步驟(1)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)取IB-RS-2細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，以細(xì)胞生長液培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35-38℃；形成良好細(xì)胞單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)；(2)細(xì)胞毒種的繁殖用病毒培養(yǎng)液將豬流行腹瀉病毒種毒按0.5-5％比例接種到步驟(1)形成的良好細(xì)胞單層繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞50-100％以上病變時(shí)收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代復(fù)壯，每次傳代產(chǎn)物進(jìn)行病毒TCID50和無菌檢測(cè)，傳至病毒TCID50穩(wěn)定且達(dá)到107.5TCID50/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，作為生產(chǎn)種子；(3)IB-RS-2細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器按總體積的30％-80％加入無菌細(xì)胞生長液，且每升無菌細(xì)胞生長液中按3-10g/L濃度加入微載體，啟動(dòng)生物反應(yīng)器，低轉(zhuǎn)速攪拌30分鐘后，取步驟(1)轉(zhuǎn)瓶上生長良好的IB-RS-2細(xì)胞，經(jīng)EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1～3×105個(gè)/mL的密度接種到反應(yīng)器中，設(shè)定適合的溫度、PH、攪拌速度、溶氧含量等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)。(4)制苗毒液的繁殖待觀察微載體上細(xì)胞長滿80％-90％，空球率低于5％，，滿球率大于80％，細(xì)胞狀態(tài)良好，且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)到1～3×106個(gè)/mL以上進(jìn)行接毒操作，按0.5-5％比例介入步驟(2)制備好的豬流行性腹瀉病毒種毒，設(shè)定適合的溫度、PH、攪拌速度、溶氧含量等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)；接毒后每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測(cè)樣品的TCID50；待觀察微載體上細(xì)胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢(shì)，停止反應(yīng)器攪拌，待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后，收獲上清液和微載體；(5)收獲病毒液的處理病毒液和微載體經(jīng)1次凍融后，離心或過濾去除細(xì)胞碎片后-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的生物反 應(yīng)器為能夠自動(dòng)控制溫度、PH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng) 器，容積為3L-3000L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的微載體 為Cytodex系列微載體，微載體在使用前需清洗、滅菌，方法如下1)用PBS浸泡微載體三 小時(shí)以上；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，12rC蒸汽滅菌三十分鐘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的 EDTA-胰酶細(xì)胞分散液配方為質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別是0.25%的規(guī)格為1 : 250的胰酶、 0. 02 %的EDTA的Hank' s液。細(xì)胞生長液的配方為質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是90% -98% MEM液、2X _10%牛血清、終濃度為 100-200IU/mL的抗菌素，PH為6. 8-7. 6。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的種毒接 種量為0. 5-5%，病毒培養(yǎng)液配方為含血清l-4X的MEM液、終濃度為100-200IU/mL的抗菌素，ra調(diào)整為7. 2-7.4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的生物反 應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為培養(yǎng)溫度33-38°C、 P朋.5-7. 68、溶氧30% -70%、攪拌速度30-80rpm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)IB-RS-2細(xì)胞生產(chǎn)豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)工藝，本發(fā)明包涵不同豬流行性腹瀉病毒毒株的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明包括如下技術(shù)步驟(1)選擇IB-RS-2細(xì)胞作為制苗用細(xì)胞系；(2)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)；(3)豬流行性腹瀉病毒細(xì)胞毒種的繁殖；(4)IB-RS-2細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng)；(5)豬流行性腹瀉病毒抗原的繁殖；(6)收獲病毒抗原液的處理。本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，投入產(chǎn)出比提高6-8倍。而且生產(chǎn)周期短，占用場(chǎng)地小，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，環(huán)境污染少且易于處理，自動(dòng)化程度高，用人少，質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定?？娠@著降低生產(chǎn)成本、提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號(hào)C12N7/00GK101775374SQ201010103688
公開日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2010年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月1日
發(fā)明者劉玉才, 徐宏軍, 胡來根 申請(qǐng)人:成都天邦生物制品有限公司