Tspan15在制備骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及TSPAN15在制備骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，0A)是一種隨著年齡的增長而發(fā)生率明顯增加的 退行性關(guān)節(jié)炎疾病，也是老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，膝 骨性關(guān)節(jié)炎在女性患病率中占第四位，隨著年齡的增長，其患病率也明顯上升，大于65歲 的人群中50%以上都有骨性關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)。目前對于骨性關(guān)節(jié)炎的治療方法主要是 早期采用非手術(shù)治療，止痛、保護和延緩軟骨的退化；晚期軟骨破壞嚴重，有剝脫或者游離 體，骨贅增生等，此階段就要采用手術(shù)治療，例如關(guān)節(jié)清理、截骨術(shù)或融合術(shù)、人工關(guān)節(jié)置換 術(shù)等，而漫長的保守治療和昂貴的手術(shù)費用對于骨性關(guān)節(jié)炎這種慢性疾病尤不適合。因此， 明確0A的發(fā)病機制，找尋預(yù)防0A、早期干預(yù)并延緩軟骨退變進程的方法就成為醫(yī)學上亟待 解決的問題。
[0003] 發(fā)明人對7例骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織及4例對照樣本進行高通量測序，結(jié)合生物信 息學方法進行基因篩選，在差異表達明顯的基因中挑選出高表達的候選基因TSPAN15，現(xiàn)有 研究中并沒有TSPAN15和骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的報道，進一步，發(fā)明人進行了分子細胞生物學 方法驗證，證實了TSPAN15在骨性關(guān)節(jié)炎組織中高表達，TSPAN15抑制劑可用于制備治療骨 性關(guān)節(jié)炎藥物。本發(fā)明提供了一種新的骨性關(guān)節(jié)炎的治療靶點，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑，所述骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑檢測 TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表達產(chǎn)物。
[0005] 進一步，所述骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片、免疫方法 檢測骨性關(guān)節(jié)炎組織中TSPAN15基因的表達，優(yōu)選的，所述的熒光定量PCR試劑盒中含有一 對特異性擴增TSPAN15基因的引物；所述的基因芯片中包括與TSPAN15基因的核酸序列雜 交的探針，更優(yōu)選的，熒光定量PCR試劑盒內(nèi)含有特異性檢測TSPAN15基因的上游引物和下 游引物，上游引物序列為SEQIDN0. 9,下游引物序列為SEQIDN0. 10。
[0006] 進一步，所述的骨性關(guān)節(jié)炎的診斷制劑采用免疫方法檢測骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中 TSPAN15基因的表達產(chǎn)物，優(yōu)選的，所述免疫方法為ELISA檢測和/或膠體金檢測。
[0007] 進一步，所述檢測TSPAN15表達產(chǎn)物的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。所 述試劑盒中的抗體可采用市售的TSPAN15單克隆抗體。進一步，所述的試劑盒包括：包被 TSPAN15單克隆抗體的固相載體，酶標抗體，酶的底物，蛋白標準品，陰性對照品，稀釋液，洗 滌液，酶反應(yīng)終止液等。
[0008] 進一步，所述檢測TSPAN15蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采 用市售的TSPAN15單克隆抗體。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析技 術(shù)或膠體金滲濾法。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)（T)噴點 有抗TSPAN15單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點有免疫球蛋白IgG。
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供上述骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎診斷工具中 的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑，所述制劑中含有抑制 TSPAN15基因的轉(zhuǎn)錄或表達的試劑或化合物。
[0011] 進一步，所述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑中含有激活TSPAN15的抑制基因、激活抑制 TSPAN15表達的蛋白、導(dǎo)入抑制TSPAN15轉(zhuǎn)錄或表達的siRNA、激活促進TSPAN15mRNA降解 的microRNA、導(dǎo)入促進TSPAN15蛋白降解的分子、抑制促進TSPAN15表達的因子及蛋白的表 達。
[0012] 優(yōu)選的，所述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑含有下列中的一組或幾組siRNA:SEQID NO. 1 和SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5 和SEQIDNO. 6。更優(yōu)選 的，所述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑含有siRNA序列為SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6。
[0013] 本發(fā)明的目的在于提供上述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎治療藥物 或試劑中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種促進軟骨細胞增殖制劑，所述促進軟骨細胞增殖制劑 中含有抑制TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表達產(chǎn)物的化合物。
[0015] 進一步，所述促進軟骨細胞增殖制劑中含有激活TSPAN15的抑制基因、激活抑制 TSPAN15表達的蛋白、導(dǎo)入抑制TSPAN15轉(zhuǎn)錄或表達的siRNA、激活促進TSPAN15mRNA降解 的microRNA、導(dǎo)入促進TSPAN15蛋白降解的分子、抑制促進TSPAN15表達的因子及蛋白的表 達。
[0016] 優(yōu)選的，所述促進軟骨細胞增殖制劑含有下列中的一組或幾組siRNA:SEQID Ν0· 1 和SEQIDΝ0· 2、SEQIDΝ0· 3 和SEQIDΝ0· 4、SEQIDΝ0· 5 和SEQIDΝ0· 6。更優(yōu)選 的，所述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑含有siRNA序列為SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6。
[0017] 本發(fā)明的目的在于提供上述促進軟骨細胞增殖制劑在制備促進軟骨細胞增殖工 具中的應(yīng)用。
[0018] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過高通量測序結(jié)合生物信息學方法篩選到候選基 因TSPAN15基因，進而通過分子細胞生物學方法驗證了TSPAN15基因與骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系： TSPAN15基因在滑膜組織中高表達，與骨性關(guān)節(jié)炎具有很好的相關(guān)性，可用于制備骨性關(guān)節(jié) 炎輔助診斷制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價值。
[0019] 本領(lǐng)域人員熟知抑制基因及其表達產(chǎn)物的表達通?？梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊环N 和/或幾種：通過激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表達的蛋白、采用RNA干擾技術(shù)抑制目的基因表達、激活促進目的基因mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進目的 基因編碼蛋白降解的分子、抑制促進目的基因表達的因子及蛋白的表達。
[0020] RNA干擾（RNAi)是指外源性和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的 mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷 體內(nèi)某種特定基因的表達，促使mRNA降解，使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的技術(shù)。siRNA 設(shè)計完成后可以采用直接合成法或者構(gòu)建siRNA表達載體，制備好的siRNA可以通過磷酸 I丐共沉淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機械法、陽離子 脂質(zhì)體試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細胞。
[0021] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標 記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板 的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現(xiàn)了絕對定 量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強、結(jié)果清晰。
[0022] 基因芯片又稱為DNA微陣列（DNAmicroarray)，可分為三種主要類型：1)固定在聚 合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標記的 靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進行檢測。2)用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣 列，通過與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸 探針陣列，與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。基因芯片作為一種先進的、大規(guī)模、高通量 檢測技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點有以下幾個方面：一是高度的靈敏性和準確性；二是 快速簡便；三是可同時檢測多種疾病。
[0023] 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優(yōu)點。ELISA檢測試劑盒根據(jù)檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的ELISA。ELISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HRP)或者堿性磷 酸酶（AP)。
[0024] 常用的免疫膠體金檢測技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強標記， 使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合， 然后進行負染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。（3)斑點免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標記的抗體檢測相 應(yīng)的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠 體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后相互反應(yīng)，當移動至固 定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留， 聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方 便。
[0025] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測骨性關(guān)節(jié)炎的基因檢測試劑盒，所述試劑盒檢測 基因TSPAN15，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQIDN0. 9，下游引物序 列為SEQIDN0. 10。
[0026] 進一步，該PCR試劑盒適合于目前存在市