一種與高血壓易感性相關(guān)的基因變異位點(diǎn)及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，涉及人線粒體融合基因2(Mitofusin 2，Mfn2 gene) 5’端非編碼區(qū)-2517與-2518位點(diǎn)之間的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)及其與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的檢測。本發(fā)明還涉及檢測這個(gè)SNP位點(diǎn)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性高血壓(Essential hypertens1n, EH)是一種常見而多發(fā)的、由環(huán)境與遺傳因素共同致病的多因素、多基因疾，對人類健康造成了極大的影響。隨著分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的高血壓相關(guān)基因已經(jīng)有150余種，但是的發(fā)病機(jī)制仍然不完全清楚，高血壓的早期診斷和預(yù)防問題仍然未能完全解決。EH是遺傳因子和環(huán)境共同作用的結(jié)果，血壓的變化30%-60%歸因于遺傳。由于環(huán)境因素是可以控制和確認(rèn)的，而對高血壓遺傳學(xué)因素卻是固定不變的。因此，對可變因素的控制，如對高血壓危險(xiǎn)因素的預(yù)防，可以在一定程度上延緩和防止高血壓的發(fā)病，但是對固定不變的遺傳因素的認(rèn)識不足卻在一定程度上嚴(yán)重影響著對高血壓發(fā)病、診斷和治療。因此對高血壓遺傳學(xué)的研究十分必要(王佐廣，溫紹君，吳兆蘇.高血壓、易感基因與單核苷酸多態(tài)性[J].高血壓雜志，2001，9:259-264)。
[0003]近二十余年來，有關(guān)高血壓治療的研究更多地集中在對血壓的控制和對靶器官的保護(hù)，并已取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。但是，這些手段并不能從根本上控制血壓，目前對人類內(nèi)源性抗高血壓基因的研究還很少，因此，研究內(nèi)源性抗高血壓機(jī)制是今后高血壓防治研究的主要方向之一，具有重要的研究價(jià)值和應(yīng)用前景，如果通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗高血壓機(jī)制治療高血壓病，將會促進(jìn)我國生物醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，并為我國每年節(jié)省巨大的醫(yī)療費(fèi)用。
[0004]目前所發(fā)現(xiàn)的高血壓相關(guān)基因，歸結(jié)起來可以概括為促高血壓基因和抗高血壓基因，Mfn2屬于后者。Mfn2的前身是我國學(xué)者陳光慧等[Chen GH, Zhang CH, Zhu YQ, et al.Express1n of a novel gene related to hypertens1n[J].Natl Med J China, 1997,77: 823-828.]于1997年對培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和正常Wistar Kyoto (WKY)大鼠的血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行差異顯示，克隆出一個(gè)新基因一一增殖抑制基因(hyperplasiasuppressor gene，HSG)。它包含有4160bp的喊基對，共編碼661個(gè)氨基酸(NM_014874,GeneBank Access U41803)。后經(jīng)一系列體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[Chen KH, Guo XM, DalongMa, et al.Dysregulat1n of HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nature Cell B1l, 2004, 6，872-883.]，HSG 可以明顯地抑制 Ras-Raf 蛋白-絲裂素活化蛋白激酶基因表達(dá)，并且可以激活抗癌基因的表達(dá)，有效地阻遏細(xì)胞周期和抑制多種細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用是通過細(xì)胞凋亡的方式實(shí)現(xiàn)的。因此，HSG基因是原發(fā)性高血壓的候選基因之一，后經(jīng)基因功能研究表明，HSG基因參與線粒體融合，因此正式命名為線粒體融合基因 2 (Mitofusin 2，Mfn2)。
[0005]由于Mfn2基因在原發(fā)性高血壓患者和自發(fā)性高血壓大鼠血管和白細(xì)胞中主要的特點(diǎn)是出現(xiàn)表達(dá)下降，這應(yīng)該是其表達(dá)調(diào)控出現(xiàn)了異常，但是目前對Mfn2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究較少。5’端非編碼區(qū)是處于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，是啟動子和主要轉(zhuǎn)錄因子存在部位，5’端非編碼區(qū)-2517與-2518位點(diǎn)之間(從起始密碼子的“A”起向上第2517位與2518位之間的位置，在SEQ ID NO: 1中為第33與34位核苷酸之間)變異正好處于這個(gè)位置。我們在進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)位于Mfn2基因5’端非編碼區(qū)內(nèi)，且處于相對保守的區(qū)域。另外，該變異位點(diǎn)是一些非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Hb、SRY和BR-C Z等的潛在結(jié)合部位，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控角度而言，具有非常重要的價(jià)值，因而可能具有非常重要的意義。
[0006]綜上所述，為了最終實(shí)現(xiàn)根治原發(fā)性高血壓，本領(lǐng)域迫切需要深入研究原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制，尋找原發(fā)性高血壓易感基因，篩選出具有高風(fēng)險(xiǎn)的原發(fā)性高血壓患者，開發(fā)檢測原發(fā)性高血壓易感基因的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種檢測高血壓易感基因Mfn2多態(tài)性位點(diǎn)的方法及檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明提供了一種可以通過高血壓易感性基因的檢測預(yù)測高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，即檢測Mfn2基因5’端非編碼區(qū)-2518位點(diǎn)的基因型。5’端非編碼區(qū)-2517與-2518位點(diǎn)之間為ins AA變異的基因型的個(gè)體其高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于普通人群。
[0009]所述的5’端非編碼區(qū)-2517與-2518位點(diǎn)，位于Mfn2的5’端非編碼區(qū)中(Chromosome 1 - NC_00000L 11 區(qū)域的 11977663…11977664 位點(diǎn)之間)。其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號:5’端非編碼區(qū)-2517與-2518位點(diǎn)的位置基于SEQ ID NO:1 ;引物1基于SEQ ID NO:2 ;引物2基于SEQ ID NO:3 ;擴(kuò)增產(chǎn)物基于SEQ ID NO:4。
[0010]具體而言，該方法包括步驟:(a)抽提樣品的基因組DNA，擴(kuò)增獲得Mfn2基因5’端非編碼區(qū)；(b)通過特異性的引物擴(kuò)增獲得Mfn2基因包含5’端非編碼區(qū)-2517與-2518位點(diǎn)之間的區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物為SEQ ID NO:4 ；(c)檢測步驟(b)產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5’端非編碼區(qū)-2517與-2518位點(diǎn)之間的區(qū)域的基因型。
[0011]所述的擴(kuò)增Mfn2基因5’端非編碼區(qū)的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
[0012]上述方法中涉及的測序、擴(kuò)增、抽提基因組DNA等技術(shù)均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作方法。
[0013]本發(fā)明提供了一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，它含有可以包括特異性擴(kuò)增Mfn2基因5’端非編碼區(qū)中包含-2517與-2518位點(diǎn)之間的區(qū)域的引物。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，與特異性擴(kuò)增Mfn2基因5’端非編碼區(qū)中包含_2517與-2518位點(diǎn)的區(qū)域的引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
[0015]本發(fā)明經(jīng)研究顯示，首次證明了 Mfn2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5’端非編碼區(qū)-2517與-2518位點(diǎn)(位于Mfn2 5’端非編碼區(qū)中，Chromosome 1 - NC_000001.11區(qū)域的11977663…11977664位點(diǎn)之間AA/-)與高血壓密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能:Mfn2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5’端非編碼區(qū)-2517與-2518位點(diǎn)(Chromosome 1 - NC_000001.1l區(qū)域的11977663…11977664位點(diǎn)之間)基因型的改變將導(dǎo)致高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高。其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在Mfn2基因5’端非編碼區(qū)-2517與-2518位點(diǎn)之間AA/-在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P〈0.05)，即在原發(fā)性高血壓患者中該基因型主要表現(xiàn)為