一種對(duì)嗜水氣單胞菌易感性相關(guān)的中華鱉微衛(wèi)星序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種對(duì)嗜水氣單胞菌易感的 中華整微衛(wèi)星序列及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 W02] 中華整，又稱甲魚、王八、水魚、元魚、團(tuán)魚、腳魚和老整，英文名化inese Soft-shelledTurtle,拉下文名（Pelodiscussinensis),中國(guó)除寧夏、新疆、青海及西藏 未見報(bào)道外，其余各省、市、自治區(qū)均有分布，W長(zhǎng)江流域和華南地區(qū)為多見；國(guó)外分布于日 本、朝鮮和越南。中華整由于其藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，長(zhǎng)期被大量消耗，而品種是中華整養(yǎng) 殖的物質(zhì)基礎(chǔ)之一（品種、飼料、水質(zhì)），良種的選擇和育種是增產(chǎn)的有效途徑，同時(shí)也可 W間接起到節(jié)能減排的作用。一般認(rèn)為，在其它條件相同的情況下，使用優(yōu)良品種可增產(chǎn) 20~30%，因此要發(fā)展"高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效"的中華整養(yǎng)殖業(yè)，對(duì)良種的選育應(yīng)該引起足夠的 重視。遺傳改良或品種培育是中華整養(yǎng)殖發(fā)展的動(dòng)力，研究表明，遺傳變異水平與生物的生 長(zhǎng)速度、抗嗜水氣單胞菌能力與生產(chǎn)性狀密切相關(guān)，因此，本發(fā)明欲建立一種篩選方式，將 中華整對(duì)嗜水氣單胞菌易感的個(gè)體用微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，微衛(wèi)星序列微 衛(wèi)星標(biāo)記的基本原理是根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星 片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計(jì)算等位基因頻率，再 通過關(guān)聯(lián)分析判斷其對(duì)嗜水氣單胞菌的易感性，進(jìn)一步應(yīng)用于分子輔助育種。
[0003] 分子標(biāo)記輔助選育（MA巧是遺傳育種中的重要環(huán)要節(jié)之一，它的原理是根據(jù)與某 一性狀緊密相連的分子標(biāo)記的出現(xiàn)來對(duì)目標(biāo)性狀的基因型進(jìn)行選擇，MS在鑒定優(yōu)良親本， 篩選早期優(yōu)良性個(gè)體，加快育種進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。微衛(wèi)星標(biāo)記由于具有多態(tài)性豐富、 遵循孟德爾分離定律，共顯性遺傳、易于PCR擴(kuò)增、條帶易于識(shí)別等多種優(yōu)點(diǎn)成為開發(fā)的首 選。微衛(wèi)星（Microsatellites)又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)序列（Simplesequencerepeats,SSR)， 是真核生物基因組中廣泛分布的簡(jiǎn)單重復(fù)DNA片段，一般由2~6個(gè)核巧酸為基本單位組 成，其中，最常見的是雙核巧酸重復(fù)，如（(AC/TG)n及（AG/TC)n。不同的生物個(gè)體由于基 本單位重復(fù)次數(shù)的不同W及重復(fù)程度的不完全形成了微衛(wèi)星位點(diǎn)的長(zhǎng)度多態(tài)性而顯示出 多態(tài)性。研究表明，可能是DNA復(fù)制過程中的"鏈滑（strandslippage)現(xiàn)象造成微衛(wèi)星 DNA多態(tài)性信息容量（polymo;rphicinformationcontent，PIC)較高。微衛(wèi)星DNA的高突 變性、共顯性表達(dá)及其在真核生物基因組中的普遍性，目前己被廣泛用于遺傳多樣性分析， 親緣關(guān)系鑒定，連鎖圖譜構(gòu)建，功能基因定位，分子標(biāo)記選育等研究領(lǐng)域，由于每個(gè)微衛(wèi)星 兩端的序列多是相對(duì)保守的單拷貝序列，可根據(jù)其兩端設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR技術(shù)來 擴(kuò)增相應(yīng)位點(diǎn)的微衛(wèi)星序列，再經(jīng)電泳分析，即可顯示不同個(gè)體基因型微衛(wèi)星的多態(tài)性，而 且，微衛(wèi)星在基因組中分布密度很大，表現(xiàn)出高度的多態(tài)性和共顯性遺傳，能為種質(zhì)資源的 保護(hù)、合理的人工增養(yǎng)殖、人工放流方案的制定提供評(píng)價(jià)依據(jù)。因此，研究對(duì)嗜水氣單胞菌 易感的中華整，有益于研究嗜水氣單胞菌的發(fā)病機(jī)理，并為后期建立抗菌群體奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種對(duì)嗜水氣 單胞菌易感的中華整微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物，即提供1對(duì)對(duì)嗜水氣單胞菌易感的中華整微衛(wèi)星 位點(diǎn)，W及相應(yīng)的多態(tài)性微衛(wèi)星引物，從而為中華整篩選對(duì)嗜水氣單胞菌易感的個(gè)體選育 提供分子標(biāo)記。 陽〇化]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種微衛(wèi)星 位點(diǎn)為分子標(biāo)記在鑒定中華整對(duì)嗜水氣單胞菌易感個(gè)體中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種對(duì)嗜水氣單胞菌易感性相關(guān) 的中華整微衛(wèi)星序列，其核巧酸序列為SEQIDNO:1。
[0007] 本發(fā)明還提供了根據(jù)上述對(duì)嗜水氣單胞菌易感性相關(guān)的中華整微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì) 的微衛(wèi)星引物對(duì)，其序列分別為SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3,其中
[0008] 上游引物的核巧酸序列沈9 10側(cè).2為：尸:〇：4了661^4661'(：1'(：了6(：1'(：;
[0009]下游引物的核巧酸序列沈Q ID NO. 3為：R:CTCCTGGTACCCCCAAAACC。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用，該應(yīng)用不用于疾病的診斷和治療，其應(yīng)用步驟為：
[0011] 其應(yīng)用步驟為：
[0012] 1)基因組DNA的提?。菏褂没蚪MDNA提取試劑盒從中華整群體中分別提取基因 組DNA作為擴(kuò)增的模板；
[0013] 2)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增：利用該微衛(wèi)星引物對(duì)對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0014] 3)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：采用變性聚丙締酷胺凝膠電泳法及銀染法檢測(cè)微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn) 物；
[001引 4)檢測(cè)：通過檢測(cè)不同個(gè)體中微衛(wèi)星位點(diǎn)的電泳結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性分析，中華整群 體中至少存在四個(gè)等位基因，分別是119bp、143bp、16化P和179bp，其中179bp處等位基因 在中華整易感嗜水氣單胞菌群體中表達(dá)具有特異性，該微衛(wèi)星位點(diǎn)可作為篩選嗜水氣單胞 菌易感中華整個(gè)體的分子標(biāo)記。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明開發(fā)出了一類對(duì)嗜水氣單胞菌易感 的中華整微衛(wèi)星序列，本發(fā)明人還基于微衛(wèi)星的簡(jiǎn)單重復(fù)序列設(shè)計(jì)了特異性的引物，且本 發(fā)明發(fā)現(xiàn)該微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星分子標(biāo)記與中華整對(duì)嗜水氣單胞菌易感的性狀相關(guān)，本發(fā)明 的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有高度多態(tài)性和穩(wěn)定性，可進(jìn)一步應(yīng)用于中華整分子輔助育種。
【具體實(shí)施方式】
[0017] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0018] 實(shí)施例1嗜水氣單胞菌攻毒的方法的建立
[0019] 1、實(shí)驗(yàn)樣品采集
[0020] 選取200g/只的中華整黃河群體，用嗜水氣單胞菌T4菌株做攻毒處理，最先死亡 的50只為易感群體，最后死亡的為抗嗜水氣單胞菌群體（其中抗嗜水氣單胞菌的整用細(xì)菌 注射了5-6次依然很活躍）。屠宰后取其肌肉組織-80°C保存。
[0021] 2、試驗(yàn)方法
[0022] 嗜水氣單胞菌（Aeromonashy化ophila)T4菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陸承平教授惠贈(zèng)。 Τ4菌株復(fù)壯后接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28°C恒溫培養(yǎng)12h(0D600<1. 0)，用滅菌生理鹽 水洗下菌體，平板計(jì)數(shù)并稀釋到4 X 108c化/mU用1. 0 X 108c化/50g體重濃度對(duì)中華整進(jìn)行 攻毒。 W23] 中華整經(jīng)20天預(yù)飼養(yǎng)后，進(jìn)行T4菌半致死量確定，所用菌液濃度為： 1.OXIO^C即/mL、5.OXIO^C即/mL、l. 0X10化即/mL、5. 0X10化即/mL、l.OXl〇9c即/mL和 5. 0X109CFU/mU對(duì)照組注射等量的生理鹽水。注射劑量為1血，每個(gè)濃度梯度10只中華整， 共70只，統(tǒng)計(jì)攻毒10天后各組的死亡數(shù)。用半致死量濃度對(duì)養(yǎng)殖于30個(gè)水族箱的600只 健康中華整注射。實(shí)驗(yàn)間隔時(shí)間lOd，對(duì)照組注射等體積無菌生理鹽水（0.9%化C1)。日 換水率20 %，連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)整的活動(dòng)情況，W身體僵直、碰觸無反應(yīng)為死亡評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)；W趴 在料臺(tái)上不動(dòng)，反應(yīng)遲緩作為嗜水氣單胞菌整的判斷標(biāo)準(zhǔn)。每日觀察兩次，及時(shí)取出死亡個(gè) 體，W分成易感組和抗嗜水氣單胞菌組。每只中華整單獨(dú)進(jìn)行采樣，取肌肉組織冷凍保存， W備后續(xù)的DNA提取。經(jīng)過攻毒后，按照中華整死亡的順序進(jìn)行排號(hào)，易感的個(gè)體發(fā)生了嚴(yán) 重的炎癥反應(yīng)，腸道大量充血，背甲和腹甲發(fā)生穿孔，鼻腔內(nèi)流血，運(yùn)些是嗜水氣單胞菌感 染的典型癥狀。經(jīng)過連續(xù)4次攻毒后還剩下51只完好的中華整，運(yùn)些中華整體表光滑無 傷，行動(dòng)活潑，解剖后腸道沒有發(fā)生明顯的充血，腸道中可見有食物，作為抗嗜水氣單胞菌 組。同時(shí)根據(jù)抗嗜水氣單胞菌中華整的數(shù)量，選擇最早感染嗜水氣單胞菌發(fā)病的51只中華 整為易感組。
[0024] 實(shí)施例2微衛(wèi)星序列的獲得W及引物設(shè)計(jì)
[0025] 1、易感組和抗嗜水氣單胞菌組中成蟲樣本DNA的抽提 [00%] 采用DNA的酪抽提和乙醇沉淀法：
[0027] (1)取0.〇25g中華整肌肉樣品，放入1. 5血離屯、管中。加入100血STE裂解緩沖 液，在冰上用眼科小剪刀剪碎，再補(bǔ)加400血STE裂解緩沖液，50 μ L SDS (10%)，5 μ L蛋白 酶K(20mg/mL)，充分混勻后放入56°C消化地，期間比混勻一次。直至裂解液澄清。 陽02引 似加入酪/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)500血，抽提lOmin，在1200化pm條件下離 屯、lOmin。
[0029] (3)取離屯、后的上清液，重復(fù)上述步驟一次，直至水相與有機(jī)相間無蛋白質(zhì)層。
[0030] (4)取離屯、后的上清液加入等體積的氯仿/異戊醇（24 :1)500μL抽提lOmin， 12000巧m離屯、lOmin。 陽的1 ] (5)取上清液加入50μLNaAc(3M)，1000μL冷無水乙醇緩慢搖勻，可見絲狀DNA 析出。放入-20°C冰箱lOmin，使DNA充分析出。13000巧m離屯、lOmin。 陽03引 （6)小屯、的棄去上清液，用100070%乙醇洗涂沉淀，10000巧m下離屯、5min，重復(fù)一 遍。
[0033] (7)吸出乙醇，通風(fēng)干燥3-5min。
[0034] 做加入50 μ L滅菌雙蒸水，輕彈至DM全部溶解，放在-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?陽03引 （9)提取好的DNA需要用1 %瓊脂糖電泳檢測(cè)其純度。 W36] (10)采用微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)樣本DNA的濃度和純度，并稀釋到10化g/ -20°C保存。
[0037]2、微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選及引物的獲得
[0038] 對(duì)于采用微衛(wèi)星序列位點(diǎn)為遺傳標(biāo)記的種群遺傳學(xué)研究，選擇出合適的微衛(wèi)星序 列位點(diǎn)顯得尤為重要。首先，其單元結(jié)構(gòu)要求簡(jiǎn)單，因?yàn)?