嗜水氣單胞菌的lamp檢測引物組及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測引物組，包括一對外引物AH-F3和AH-B3、一對內引物AH-FIP和AH-BIP以及一對環(huán)引物AH-LF和AH-LB，其中AH-F3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，AH-B3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，AH-FIP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，AH-BIP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，AH-LF的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，AH-LB的核苷酸序列SEQ?ID?NO.6所示。本發(fā)明的試劑盒操作簡便快速，適合現(xiàn)場檢測；具有特異性強、檢測靈敏度高，可達到46fg/mL、準確率高、可靠等特點，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】嗜水氣單胞菌的LAMP檢測引物組及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于嗜水氣單胞菌檢測【技術領域】，具體涉及嗜水氣單胞菌的LAMP檢測引物組及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila, AH)廣泛分布于人的食物鏈、水體環(huán)境和泥土中?？梢酝ㄟ^飲水、皮膚創(chuàng)傷等途徑感染動物機體，能感染魚蝦、兩棲類、爬行類、禽類和哺乳類等動物，引起出血性敗血癥，造成大量死亡。同時，該菌還可引起人類食物中毒、腸胃炎、腦膜炎、肺炎及敗血癥，是一種典型的人-畜-魚共患病病原體，給人類健康帶來危害，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中危害最大的病原菌之一。國內外學者普遍認為，綜合預防是相對有效的方法，即盡早發(fā)現(xiàn)疾病并采取諸多措施阻止細菌傳播。因此，建立靈敏、準確、快捷、方便的嗜水氣單胞菌檢測方法是減少嗜水氣單胞菌的發(fā)生和危害的重要途徑。
[0003]目前嗜水氣單胞菌的檢測方法主要有生化檢驗法、免疫學方法和分子生物學方法等。生化鑒定方法由于氣單胞菌屬的種類繁多，而且它們的生化性狀極為相似，需要采取一系列生化鑒定反應才能夠鑒定到種，這種方法步驟繁瑣耗時、特異性和靈敏度低，遠不能滿足日?？焖贆z測工作的需要。免疫酶聯(lián)檢測方法(ELISA)可以快速檢測細菌，但必需先制備相關抗體，步驟繁瑣耗時。PCR技術具有靈敏、特異、快速等優(yōu)點，廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原的檢測中。但PCR技術對實驗人員和環(huán)境的要求高，儀器設備貴、操作步驟多。與一般PCR技術相比，熒光PCR檢測技術簡化了操作步驟，而且可消除擴增產(chǎn)物引起的交叉污染，減少假陽性的發(fā)生。但實時熒光PCR儀器設備昂貴，無法用于現(xiàn)場檢測。我國浙江省淡水水產(chǎn)研究所潘曉藝等人發(fā)明的專利“致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒及檢測方法”(ZL201010611571.0)具有較好的特異性和靈敏度。目前檢測方法正向特異性高、更快速、更靈敏、更方便、費用更低廉化的方向發(fā)展，建立檢測嗜水氣單胞菌快速準確的LAMP方法，是適應口岸快速檢測和大通關的時代要求，對促進中國水養(yǎng)殖、食品安全及口岸檢疫有重要作用。
[0004]環(huán)介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是 NOTOMI等建立的一種新的核酸擴增技術，在60~65°C的恒溫條件下，歷時幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。LAMP反應中可形成明顯的白色焦磷酸鎂沉淀，可通過對濁度的觀察或加入熒光染料，直接通過顏色變化來判定反應結果。該技術具有高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點，已廣泛應用于細菌、細菌、寄生蟲、轉基因作物領域的檢測，并取得了較理想的效果。適合基層推廣檢測，符合疾病檢測的快速、準確的診斷需要。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是提供一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測引物組，該引物組特異性強，靈敏度高。
[0006]本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是提供一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，該試劑盒高效、快速、簡便，成本低。
[0007]本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測引物組，包括一對外引物、一對內引物和一對環(huán)引物，其中AH-F3的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，AH-B3的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，AH-FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，AH-BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，AH-LF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，AH-LB的核苷酸序列SEQ ID N0.6所示。
[0008]具體外引物、內引物和環(huán)引物的核苷酸序列如下:
[0009]外引物AH-F3:CAATGGCAGTCTGATCTCC (SEQ ID NO:1);
[0010]外引物AH-B3:TGTCGGCTCATGTCAGTA (SEQ ID N0:2)；
[0011]內引物 AH-FIP:CTGACCTGACTGCTTGGCAGCGACGATACCGTAGAGA (SEQ ID NO: 3);
[0012]內引物 AH-BIP:CGCTGCAATTGATGGTGAGCAGTTTGATATCCCGCTGC (SEQ ID N0:4)；[0013]環(huán)引物AH-LF:GGAGCCTGAACGTCATGG (SEQ ID NO: 5);
[0014]環(huán)引物AH-LB:GGCACTGACGCTGAATCT (SEQ ID NO:6)。
[0015]本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，所述試劑盒包括上述的檢測引物組。
[0016]在上述嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒中，其中內引物、環(huán)引物和外引物的摩爾比優(yōu)選為8:4:1。
[0017]本發(fā)明所述的試劑盒中還包括DNA聚合酶、LAMP反應液、封閉液、陽性對照和陰性對照。
[0018]本發(fā)明所述的DNA聚合酶優(yōu)選為Bst DNA聚合酶。
[0019]本發(fā)明所述的LAMP反應液含IOmM dNTP、10XThermoPol反應緩沖液和150mMMgSO4水溶液。
[0020]在上述LAMP反應液中，IOmM dNTP、10 X ThermoPol反應緩沖液和150mMMgS04水溶液三者優(yōu)選按體積比8:5:2組成。
[0021]在上述LAMP反應液中，所述的封閉液優(yōu)選為礦物油。
[0022]在上述LAMP反應液中，所述的陽性對照優(yōu)選為含有嗜水氣單胞菌(AH)菌毛蛋白基因的重組質粒，所述的陰性對照優(yōu)選為無菌去離子水。
[0023]本發(fā)明所述的檢測試劑盒中還可以含有核酸染料SYBR Green I。
[0024]本發(fā)明可以采用上述試劑盒檢測嗜水氣單胞菌(AH)，具體包括如下步驟:
[0025]I)核酸提取:細菌樣品按照細菌基因組提取試劑盒進行提??；
[0026]2) LAMP反應體系的建立:25 μ L反應體系含有:12.5 μ L的LAMP反應液，I μ LBstDNA 聚合酶，2 μ L 核酸提取液，AH-FIP1.6 μ Μ, ΑΗ-ΒΙΡ1.6 μ Μ, AH-LF0.8 μ Μ, AH-LB0.8 μ Μ,AH-F30.2 μ Μ, ΑΗ-Β30.2 μ Μ,無菌去離子水，設置陽性對照和陰性對照；加入兩滴封閉液，振蕩離心，濁度儀設置反應溫度為63°C，反應時間65min，反應結束后80°C保持5min ；
[0027]3)結果判斷可以采用以下三種方法之一:
[0028]方法a:采用實時濁度儀(LA-320C)檢測反應管內產(chǎn)物的濁度；
[0029]方法b為核酸染料檢測:往LAMP產(chǎn)物中加入I μ L稀釋10倍的SYBR Green I染料，通過肉眼來觀察其顏色，如果顯示核酸染料原來的橙色，則表示沒有擴增，如果顏色變綠則表示有擴增；[0030]方法c為瓊脂糖電泳檢測:取5 μ L LAMP產(chǎn)物與1 μ L6 X Buffer混合，加至2%的瓊脂凝膠進行電泳，凝膠置于EB中染色后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，觀察梯形條帶，以判斷是否有擴增。
[0031]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0032](1)快速高效:整個擴增只用65min即可完成，擴增產(chǎn)量可達IO9~IOltl個拷貝；
[0033](2)操作簡便:不需要復雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部恒溫儀就能反應和檢測；
[0034](3)高特異性:本發(fā)明對溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、大腸桿菌、遲鈍愛德華氏菌、無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、蠟樣芽胞桿菌、志賀氏菌、肺炎鏈球菌、綠膿桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、摩氏摩根菌的核酸均不發(fā)生擴增，僅對嗜水氣單胞菌擴增；
[0035](4)高靈敏度:本發(fā)明的最低檢出限達46fg/mL，比普通PCR檢測靈敏10000倍；
[0036](5)鑒定簡便:本發(fā)明可通過濁度儀、核酸染料、瓊脂糖凝膠電泳判斷是否擴增。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1是實施例3中LAMP檢測方法對嗜水氣單胞菌的特異性試驗，其中1、9、17:嗜水氣單胞菌，2、10、18陰性對照，3:溫和氣單胞菌，4:維氏氣單胞菌，5:豚鼠氣單胞菌，6:大腸桿菌，7:遲鈍愛德華氏菌，8:無乳鏈球菌，11:海豚鏈球菌，12:金黃色葡萄球菌，13:霍亂弧菌，14:蠟樣芽胞桿菌，15:志賀氏菌，16:肺炎鏈球菌，19:綠膿桿菌，20:弗氏檸檬酸桿菌，21:摩氏摩根菌；
[0038]圖2實施例3中LAMP檢測方法對嗜水氣單胞菌的靈敏度試驗，A和B =LAMP靈敏度濁度儀圖，C = LAMP靈敏度的凝膠電泳圖；D:PCR靈敏度的凝膠電泳圖；其中M = Markerl:陰性對照，2:10。，3: Κ1，4:1(T2，5:1(T3，6: 1θΛ 7:10-5，8: 1θΛ 9:10-7，10: 1θΛ 11:10-9，12:10-10 ；
[0039]圖3是實施例3中LAMP檢測方法對嗜水氣單胞菌的臨床樣品檢測試驗，其中A:實時濁度儀檢測床樣品；B:核酸染料法檢測臨床樣品，1:陰性對照2:嗜水氣單胞菌KQ2010522，3:嗜水氣單胞菌BF20120816，4:嗜水氣單胞菌SK20120912，5:嗜水氣單胞菌DSN20121018，6:嗜水氣單胞菌NH130605，其中圖B中樣品2、3、4、5、6顯色綠色。
【具體實施方式】
[0040]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。
[0041]實施例1嗜水氣單胞菌的LAMP引物組及檢測試劑盒的建立
[0042]嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，包括LAMP引物組、LAMP反應液、封閉液、BstDNA聚合酶、陽性對照和陰性對照。
[0043]DLAMP引物設計:根據(jù)從Genbank上檢索到的嗜水氣單胞菌(AH)菌毛基因序列(Genbank登錄號為CP000462.1)為靶基因，選取保守序列，利用在線設計軟件PrimerExplorer version4 (http: //primerexplorer.1p/e)設計用于檢測嗜水氣單胞菌的特異性引物，其序列見下表1:
[0044]表1引物序列表[0045]
【權利要求】
1.一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測引物組，其特征是:包括一對外引物AH-F3和AH-B3、一對內引物AH-FIP和AH-BIP以及一對環(huán)引物AH-LF和AH-LB，其中AH-F3的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，AH-B3的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，AH-FIP的核苷酸序列如SEQID N0.3所示，AH-BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，AH-LF的核苷酸序列如SEQ IDN0.5所示，AH-LB的核苷酸序列SEQ ID N0.6所示。
2.一種嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述試劑盒包括權利要求1中所述的檢測引物組、DNA聚合酶、LAMP反應液、封閉液礦物油、陽性對照和陰性對照。
3.根據(jù)權利要求2所述的嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述檢測引物組中內引物、環(huán)引物和外引物的摩爾比為8:4:1。
4.根據(jù)權利要求2所述的嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述的LAMP反應液含10mM dNTPUOXThermoPol反應緩沖液和150mM MgSOyK溶液。
5.根據(jù)權利要求4所述的嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述IOmMdNTP、10XThermoPol反應緩沖液和150mM MgSO4水溶液三者體積比為8:5:2。
6.根據(jù)權利要求2所述的嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述的陽性對照為含有嗜水氣單胞菌菌毛蛋白基因的重組質粒，所述的陰性對照為無菌去離子水。
7.根據(jù)權利要求2-6任一項所述的嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，其特征是:所述試劑盒還包括顯色劑SYBR Green I。
【文檔編號】C12Q1/04GK103911433SQ201410081651
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權日:2014年3月6日
【發(fā)明者】柯浩, 李嘉彬, 馬江耀, 馬艷平, 劉振興, 郝樂, 梁志凌 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所