一種診治骨關(guān)節(jié)炎的分子標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及HMGCS2基因在骨關(guān)節(jié)炎的診斷、治療中的 用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨關(guān)節(jié)炎為一種退行性病變，系由于增齡、肥胖、勞損、創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)先天性異常、關(guān) 節(jié)畸形等諸多因素引起的關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，又稱骨關(guān) 節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)炎、老年性關(guān)節(jié)炎、肥大性關(guān)節(jié)炎等。臨床表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓 痛、僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形等。
[0003] 人口統(tǒng)計(jì)學(xué)趨勢(shì)表明，到2020年，受關(guān)節(jié)疾病影響的人群將增加到50%，全世界 將有5. 7億人受到骨關(guān)節(jié)炎的困擾。我國社會(huì)逐漸進(jìn)入老齡化社會(huì)，因此我們將面臨骨關(guān) 節(jié)炎發(fā)病的普遍流行時(shí)期。對(duì)該病的研究十分重要和迫切。
[0004] 骨關(guān)節(jié)炎的原發(fā)異?？梢园l(fā)生在關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨、韌帶或關(guān)節(jié)周圍的神 經(jīng)肌肉組織。關(guān)節(jié)軟骨的損害是骨關(guān)節(jié)炎最明顯的變化。關(guān)節(jié)軟骨喪失是骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵 病變。隨著蛋白聚糖含量的下降，關(guān)節(jié)軟骨逐漸緩慢降解。由于骨關(guān)節(jié)炎患者的蛋白聚糖、 膠原和透明質(zhì)酸合成速率均增加，使得組織的分解代謝活性特別高。通常認(rèn)為，蛋白溶解酶 和中性金屬蛋白酶在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨丟失中是最重要的原因。關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)沒有血管 和神經(jīng)，對(duì)創(chuàng)傷、炎癥的反應(yīng)是由關(guān)節(jié)軟骨、滑膜組織或關(guān)節(jié)液中的蛋白質(zhì)如細(xì)胞因子等介 導(dǎo)的?；?duì)于維持關(guān)節(jié)的正常功能，并且在骨關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的 作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于骨關(guān)節(jié)炎（Osterarthritis，0A)早期診斷的 分子標(biāo)志物。相比傳統(tǒng)的骨關(guān)節(jié)炎的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來診斷骨關(guān)節(jié)炎的具有及 時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相 應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了檢測(cè)HMGCS2基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷骨關(guān)節(jié)炎的工具中的應(yīng) 用。
[0008] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)HMGCS2基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測(cè)HMGCS2基因mRNA水平的產(chǎn) 品、和/或檢測(cè)HMGCS2蛋白水平的產(chǎn)品。
[0009] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)HMGCS2基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫 檢測(cè)、原位雜交或芯片檢測(cè)HMGCS2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平以診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品。
[0010] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增HMGCS2基因 的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增HMGCS2基因的引 物；所述用免疫檢測(cè)診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：與HMGCS2蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用 原位雜交診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：與HMGCS2基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診 斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與HMGCS2蛋白特異性 結(jié)合的抗體，基因芯片包括與HMGCS2基因的核酸序列雜交的探針。
[0011] 所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增HMGCS2基因 的引物如SEQIDN0. 5和SEQIDN0. 6所示。
[0012] 所述檢測(cè)HMGCS2基因表達(dá)的產(chǎn)品可以是檢測(cè)HMGCS2基因表達(dá)的試劑、也可以是 包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0013] 所述診斷骨關(guān)節(jié)炎的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)； 高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷骨關(guān)節(jié)炎的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè) 人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá) 譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知HMGCS2基因的異 常與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)也屬于HMGCS2基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的工具，所述工具包括檢測(cè)HMGCS2基因表達(dá) 的試劑；所述試劑包括檢測(cè)HMGCS2基因mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)HMGCS2蛋白的抗體。
[0015] 所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0016] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固 定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)HMGCS2基因轉(zhuǎn)錄水平的 針對(duì)HMGCS2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的 HMGCS2蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測(cè)包括HMGCS2基因在內(nèi)的多個(gè)基因 (例如，與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括HMGCS2 蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)（例如與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個(gè)與 骨關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高骨關(guān)節(jié)炎診斷的準(zhǔn)確率。
[0017] 其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試 劑盒包括用于檢測(cè)HMGCS2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括HMGCS2蛋 白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或 芯片方法檢測(cè)HMGCS2基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)HMGCS2 基因的引物和/或探針。根據(jù)HMGCS2基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè) HMGCS2基因表達(dá)水平的引物和探針。
[0018] 所述試紙包括檢測(cè)HMGCS2基因表達(dá)的試劑。
[0019] 所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)HMGCS2基因表達(dá)的試劑。
[0020] 與HMGCS2基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或 其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié) 合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長度。同樣，所述 探針的長度可長至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針 長度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最 長一般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探 針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
[0021] 進(jìn)一步，所述HMGCS2蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述 HMGCS2蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗 體、8〇?￥、？&13、？(313'）2、？￥等。只要所述片段能夠保留與腿6052蛋白的結(jié)合能力即可。用 于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制 備所述抗體。
[0022] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)HMGCS2基因mRNA的引物包括SEQIDN0. 5 和SEQIDNO. 6所示的引物對(duì)。
[0023] 本發(fā)明還提供了HMGCS2基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的促進(jìn)劑在制備治療骨關(guān)節(jié)炎的 藥物中的應(yīng)用。
[0024] 所述促進(jìn)劑包括促進(jìn)HMGCS2基因表達(dá)的試劑和促進(jìn)HMGCS2基因表達(dá)產(chǎn)物的試 劑；所述促進(jìn)HMGCS2基因表達(dá)的試劑包括促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的試劑、促進(jìn)基因翻譯的試劑、促 進(jìn)HMGCS2蛋白含量的試劑；所述促進(jìn)HMGCS2基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括促進(jìn)HMGCS2基因表 達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的試劑、促進(jìn)HMGCS2基因表達(dá)產(chǎn)物活性的試劑、促進(jìn)HMGCS2基因表達(dá)產(chǎn)物功 能的試劑。
[0025] 具體地，所述促進(jìn)HMGCS2基因表達(dá)的試劑包括：含有HMGCS2基因的試劑、攜帶 HMGCS2基因的載體或宿主細(xì)胞所形成的試劑、含有HMGCS2蛋白質(zhì)的試劑。
[0026] 本發(fā)明的促進(jìn)劑一方面可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的HMGCS2蛋白的缺失或不足，通過 提尚HMGCS2蛋白的表達(dá)，從而治療因HMGCS2蛋白缺之導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎。另一方面可以用 于