二、供試材料：煙草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola)，煙草疫 霉（Phytophthora nicotianae)、致病疫霉（Phytophthora infestans)、辣椒疫霉 (Phytophthora capsici)、大豆疫霉（Phytophthora sojae)、棉疫霉（Phytophthora boehmeriae)、隱地疫霉（Phytophthora cryptogea)、棕櫚疫霉（Phytophthora palmivora)、終極腐霉（Pythium ultimum)、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum)、林棲 腐霉（Pythium sylvaticum)、稻痕病菌（Magnaporthe oryzae)、尖抱鏡刀菌（Fusarium oxysporum)、禾谷鏡刀菌（Fusarium graminearum)、花生黑腐病菌(Cylindrocladium parasiticum)、灰綠青霉（Penicillium glaucum)、黑根霉（Rhizopus nigricans)、哈茨木 霉（Trichoderma harzianum)、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani)和隨機(jī)從土壤中分離的 土壤分離真菌。除隨機(jī)從土壤中分離的土壤分離真菌外，其余所有供試材料已在表1所列 非專利文獻(xiàn)中公開，本專利申請人云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所從申請日起二十 年內(nèi)向公眾發(fā)放表1所列病菌，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所地址：云南省昆明 市盤龍區(qū)北京路2238號，郵編：650205。
[0032] 土壤分離真菌為在云南省大理州彌渡縣煙田中隨機(jī)取的土壤，按稀釋平板法培養(yǎng) 分離而得。
[0033] 三、快速分子檢測
[0034] (1)供試菌株基因組DNA的提取
[0035] 各供試菌株基因組DNA的提取均采用CTAB法提取供試菌株的基因組DNA，具體方 法為：
[0036] ①在1. 5的EP離心管中加入900 μ 1 2% CTAB提取液和90 μ 1 10% SDS ;2% CTAB 提取液組成為：2% CTAB，100mmol/L Tris-HCl (ΡΗ8. 0)，20mmol/L EDTA(PH8. 0)和0· 5mol/ L NaCl〇
[0037] ②收集供試菌株的菌絲體，用濾紙壓干水分，將菌絲組織用液氮研磨成粉末，磨細(xì) 的粉末加入到已裝好900μ1 2 %CTAB提取液和90μ1 10 %SDS的EP管中，渦旋振蕩lmin 充分混勻，置于65°C水浴lh，每隔lOmin上下顛倒2-3次混勻；水浴lh后12000rpm離心 15min，取上清液加入等體積的混合液A振蕩混勻，所述混合液A為酚、氯仿和異戊醇按酚： 氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1混合而成。
[0038] ③12000rpm離心5min，取上清液，加入等體積的氯仿，振蕩混勾，12000rpm離心 5min，取上清，加入等體積的冰異丙醇充分混勾，-20°C放置lh，12000rpm離心lOmin;棄上 清液，加入700μ1冰的體積分?jǐn)?shù)為70 %乙醇洗滌2次，12000rpm離心lmin，棄上清；在超 凈工作臺中將EP管中的白色沉淀吹干，加入含有RNase的滅菌超純水進(jìn)行溶解，即得到基 因組DNA溶液；用Nanodrop測定DNA樣品的濃度，稀釋至lOOng/μ1，置于-20°C備用。
[0039] (2) PCR反應(yīng)
[0040] 以上述提取的基因組DNA為模板，用上游引物Tbas-tubF和下游引物Tbas-tubR 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0041] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)體系總體積20 μ 1，其中l(wèi)OXreaction Buffer 2yl，100mmol/L MgCl2bufTer 1.2yl，2.5mmol/L dNTP Mixture 1.6卩1，10卩111〇1/1^上游 引物Tbas-tubF 0.4 μ 1，10 μ mol/L下游引物Tbas-tubR 0.4 μ 1，5U/μ 1 rTaq Polymerase 〇. 1 μ 1，模板DNA 1 μ 1，滅菌超純水補(bǔ)足總體積。
[0042]PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，60°C退火30s，72°C延伸40s，共 35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0043] (3)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果
[0044] PCR反應(yīng)結(jié)束后取5μ1擴(kuò)增產(chǎn)物與2μ1的6X上樣緩沖液混勾，經(jīng)1. 5 %瓊脂糖 凝膠電泳分離，經(jīng)核酸生物染料染色后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照觀察，結(jié)果如圖1所示。除了 煙草根黑腐病菌基因組DNA特異性地?cái)U(kuò)增出大小為254bp的片段外，檢測的其它煙草疫霉、 致病疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、棉疫霉、隱地疫霉、棕櫚疫霉、終極腐霉、瓜果腐霉、林棲腐 霉、稻瘟病菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、花生黑腐病菌、立枯絲核菌、灰綠青霉、黑根霉、哈 茨木霉、土壤分離真菌用作對照的DNA均未能擴(kuò)增出任何產(chǎn)物，表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的上游引 物Tbas-tubF和下游引物Tbas-tubR具有很強(qiáng)的特異性，只能檢測到煙草根黑腐病菌的存 在，可以用于生產(chǎn)實(shí)踐中對煙草根黑腐病的快速診斷和鑒定。
[0045] 實(shí)施例2本發(fā)明引物對煙草根黑腐病菌的靈敏性檢測
[0046] 1. DNA濃度稀釋：提取的煙草根黑腐病菌基因組DNA經(jīng)Thermo NanoDrop分光光 度計(jì)測定濃度后，采用10倍系列稀釋基因組DNA濃度為100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、 100fg、10fg、lfg備用。
[0047] 2.用本發(fā)明上游引物Tbas-tubF和下游引物Tbas-tubR對煙草根黑腐病菌的靈敏 性檢測
[0048] 利用上游引物Tbas-tubF和下游引物Tbas-tubR分別對煙草根黑腐病菌10倍系 列稀釋基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序與實(shí)施例1相同。
[0049] 3.檢測結(jié)果：PCR結(jié)束后進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖2顯示， 在20μ1PCR反應(yīng)體系中，以煙草根黑腐病菌基因組DNA為模板，從100ng至10pg均可擴(kuò)增 出一條大小為254bp的特異性條帶，而DNA濃度低于lpg時，未能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，表明： 本發(fā)明引物的檢測靈敏度可達(dá)l〇pg，檢測靈敏度高，能夠?qū)ξ⒘康臒煵莞诟【M(jìn)行檢 測。
[0050] 實(shí)施例3煙草發(fā)病組織中根黑腐病菌的早期診斷
[0051] 1.煙草根黑腐病病樣組織的準(zhǔn)備
[0052] 將濃度約為IX105cfu/ml的煙草根黑腐病菌分生孢子懸浮液或者用手術(shù)刀切 取PDA培養(yǎng)1周的煙草根黑腐病菌菌絲塊接種在生長6周的煙草品種紅花大金元根莖部， 22~23°C人工氣候箱中保濕培養(yǎng)。分別取接種后6h、12h、24h、48h、72h和5d的煙草根莖 部作為病樣組織用于DNA的提取。
[0053] 2.煙草帶病組織DNA快速提取及PCR擴(kuò)增
[0054] 分別將煙草根黑腐病菌侵染611、1211、2411、4811、7211和5(1的煙草帶病病莖或病根組 織按照NaOH快速裂解法提取DNA，具體如下：
[0055] 侵染煙草根黑腐病菌的煙草帶病病莖或病根組織用自來水清洗干凈、吸水紙吸 干水分，用手術(shù)刀切取發(fā)病組織置于研缽中；按lmg病組織加入10μ1裂解液（0. 5mol/L Na0H，0. 5%PVP)計(jì)量，在研缽中充分將病組織研磨后轉(zhuǎn)移至1. 5ml的離心管中，12000rpm 離心5min;取100μ1上清液與等體積的pH8. 0的0.lmol/LTris混勾；取1μ1混合液作 為模板直接用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序?yàn)榕c實(shí)施例1相 同，每個病樣組織DNA樣品3次重復(fù)。
[0056] 3.檢測結(jié)果
[0057] PCR結(jié)束后進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖3所示，用作陰性對照 的健康煙草植株、煙草根黑腐病菌侵染6h、12h的病樣組織沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；而煙草根黑腐 病菌侵染24h、48h、72h和5d的病樣組織與用作陽性對照的根黑腐病菌DNA均擴(kuò)增出了 一條清晰的大小為254bp的條帶，表明：煙草組織中檢測出了根黑腐病菌，發(fā)病組織感染 了煙草根黑腐病菌。結(jié)果還進(jìn)一步表明：通過煙草帶病組織采用本發(fā)明提供的上游引物 Tbas-tubF和下游引物Tbas-tubR及煙草根黑腐病菌的快速分子檢測方法在根黑腐病菌侵 染的初期階段即6h和12h時，不能從煙草組織中檢測到病原菌，但是在根黑腐病菌侵染煙 草24h及以后，即在煙草植株尚未顯病癥的早期階段，能從煙草組織中檢測到病原菌，能對 根黑腐病菌進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和鑒定，能對及時采取科學(xué)合理的防治措施控制煙草根黑腐病 病害的發(fā)生、流行，減少病害造成的經(jīng)濟(jì)損失提供科學(xué)依據(jù)。
[0058] 表1實(shí)施例1檢測所用病原菌材料的相關(guān)信息
[0059]

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種煙草根黑腐病菌分子檢測引物，其特征在于：所述煙草根黑腐病菌分子檢測引 物由上游引物Tbas-tubF和下游引物Tbas-tubR組成，所述上游引物Tbas-tubF的堿基序 列如SEQIDN0:1所示，所述下游引物Tbas-tubR的堿基序列如SEQIDN0:2所示，目標(biāo)產(chǎn) 物片段長度為254bp。2. -種煙草根黑腐病菌的快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 從待檢煙草植物組織中提取基因組DNA; (2) 以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的煙草根黑腐病菌分子檢 測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3) 取5~8μ1步驟（2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)核酸生物染料染色 后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照觀察，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出一條254bp的片段，則待檢煙草植 物組織中存在煙草根黑腐病菌。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述煙草根黑腐病菌的快速檢測方法，其特征在于：步驟（2)所 述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)體系總體積20μ1，其中l(wèi)OXreactionBuffer2μ1， 100mmol/LMgCl2bufTer1· 2μ1，2. 5mmol/LdNTPMixture1· 6μ1，10μmol/L上游引 物Tbas-tubF0.4μ1，10μmol/L下游引物Tbas-tubR0.4μ1，5U/μ1rTaqPolymerase 〇. 1μ1，模板DNA1μ1，滅菌超純水補(bǔ)足總體積；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4min，94°C變 性40s，60°C退火30s，72°C延伸40s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10min。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種煙草根黑腐病菌分子檢測引物及其快速檢測方法。本發(fā)明根據(jù)煙草根黑腐病菌β-tubulin基因序列與其他物種進(jìn)行多重比對分析，設(shè)計(jì)出一對檢測靈敏高、特異性強(qiáng)，能對田間煙草根黑腐病進(jìn)行的早期診斷和病菌監(jiān)測和鑒定的特異性引物，其檢測靈敏度可達(dá)10pg，煙草感染根黑腐病菌在24小時即能檢測出，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為254bp。本發(fā)明對于煙草根黑腐病害的鑒定及早期監(jiān)測，對該病害及時防治提供了及時準(zhǔn)確的檢測方法和科學(xué)依據(jù)。
【IPC分類】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105274241
【申請?zhí)枴緾N201510808932
【發(fā)明人】趙志堅(jiān), 戶艷霞, 曹繼芬, 楊明英, 王新中, 徐發(fā)華, 周麗鳳
【申請人】云南省煙草公司大理州公司, 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年11月21日