專利名稱：一種白僵菌及其制備2-香豆?jié)M酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白僵菌，具體屬于一種白僵菌及其制備2-香豆?jié)M酮的方法。

背景技術(shù)：
2-香豆?jié)M酮(2-coumaranone)，又名正羥基苯乙酸內(nèi)酯，是一種合成殺蟲(chóng)劑和生理學(xué)試劑的原材料。2-香豆?jié)M酮目前主要是通過(guò)化學(xué)合成的方法得到，不僅成本高，產(chǎn)量低，而且生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品污染環(huán)境。如果利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生2-香豆?jié)M酮的方法就有可能解決上述問(wèn)題。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)2-香豆?jié)M酮的白僵菌。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用該菌種制備2-香豆?jié)M酮的方法。
本發(fā)明提供的一種產(chǎn)2-香豆?jié)M酮的白僵菌，卵孢白僵菌(Beauveria tenella)CGMCC NO.2382。該菌種，是本發(fā)明人從河北省承德縣沙陀子鄉(xiāng)瓦房店村油松林油松毛蟲(chóng)蟲(chóng)尸上分離獲得的，鑒定為白僵菌屬(Beauveria)的卵孢白僵菌(Beauveria tenella)。該菌種的菌株已于2008年3月3日在北京中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了保藏，保藏中心地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼為100101，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.2382。
形態(tài)特征該菌種菌絲棉絮狀，表面色澤白色，在PDA培養(yǎng)基上呈不同程度的淺紫色至紅色，菌絲長(zhǎng)而細(xì)，直徑為1.5-2.0μm，具有隔膜.產(chǎn)孢細(xì)胞有各種形狀，膨大的至細(xì)絲狀生于主干的分枝上，或與主軸呈直角的小枝梗上聚集成緊密的頭狀.孢子亞圓至橢圓形，長(zhǎng)直徑為2.0μm-6.0μm，短直徑1.5μm-3.0μm，生于產(chǎn)孢細(xì)胞頂端所延伸的“之”字型絲狀器上。
生理生化特征該菌種在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度20-27℃的條件下均可生長(zhǎng)。菌株能利用葡萄糖，可產(chǎn)生胞外蛋白酶、脂酶、幾丁質(zhì)酶，對(duì)松毛蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性。
本發(fā)明提供的一種制備2-香豆?jié)M酮的方法，包括如下步驟 (1)將保藏號(hào)為CGMCC NO.2382的卵孢白僵菌菌種接入斜面培養(yǎng)基，在溫度20-27℃，相對(duì)濕度60-85％下培養(yǎng)7-10天，得到斜面菌種； (2)將斜面菌種在無(wú)菌條件下接入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度20-27℃培養(yǎng)7-10天，得到種子液； (3)將種子液接入裝有液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在溫度20-27℃培養(yǎng)7-10天，得到菌種發(fā)酵液； 所述的固體斜面培養(yǎng)基的組分和配比蛋白胨8-15g/L，酵母浸出膏8-15g/L，葡萄糖30-50g/L，瓊脂15-25g/L，蒸餾水定容；所述的液體培養(yǎng)基的組分和配比蛋白胨8-15g/L，酵母浸出膏8-15g/L，葡萄糖30-50g/L，蒸餾水定容； (4)將培養(yǎng)好的菌種發(fā)酵液在5000r/min下離心15-30min，除去菌絲體，將上清液在45-50℃下濃縮至原體積的1/4-1/5，室溫下加入3倍體積95％乙醇，靜置24h-36h，4000r/min下離心10-20min，去除沉淀，上清液脫醇后，加入1.5-2.5倍體積的乙酸乙酯，萃取三次，所得有機(jī)相濃縮干燥，得粗提物干粉； (5)將粗提物干粉用常壓硅膠色譜進(jìn)行分離，得到含有2-香豆?jié)M酮的物質(zhì)。
所述的固體斜面培養(yǎng)基的組分和配比優(yōu)選為蛋白胨10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水定容。所述的液體培養(yǎng)基的組分和配比優(yōu)選為蛋白胨10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，蒸餾水定容。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明通過(guò)微生物發(fā)酵的方法制備得到2-香豆?jié)M酮，與化學(xué)合成的方法相比，方法簡(jiǎn)單，成本低，而且生產(chǎn)過(guò)程不產(chǎn)生污染。
本發(fā)明所提供的卵孢白僵菌(Beauveria tenella)CGMCC NO.2382不僅可用于2-香豆?jié)M酮的提取，也可用于防治松毛蟲(chóng)。
說(shuō)明書附圖


圖1含有2-香豆?jié)M酮的物質(zhì)的GC/MS檢測(cè)氣相色譜圖 圖2
圖1中峰2與2-香豆?jié)M酮的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比較
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 2-香豆?jié)M酮的制備，包括如下步驟 (1)將保藏號(hào)為CGMCC NO.2382的卵孢白僵菌菌種接入斜面培養(yǎng)基，在溫度25℃，相對(duì)濕度75％下培養(yǎng)7天，得到斜面菌種； (2)將斜面菌種在無(wú)菌條件下接入裝有200ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱，25℃下180r/min，培養(yǎng)7天，得到種子液； (3)在7L液體發(fā)酵罐中，裝入5L的液體培養(yǎng)基，將1瓶上述培養(yǎng)好的種子液接入發(fā)酵罐中，在25±0.5℃，375±5r/min下培養(yǎng)7天，得到菌種發(fā)酵液； 所述固體斜面培養(yǎng)基配比蛋白胨10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水定容；所述液體培養(yǎng)基配比蛋白胨10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，蒸餾水定容；固體斜面培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基在制備時(shí)均要通過(guò)常規(guī)方法滅菌； (4)將培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵液于5000r/min下離心20min，去除菌絲體。然后將上清液于50℃下濃縮至原體積的1/5，室溫下加入3倍體積95％乙醇，醇沉，靜置24h，4000r/min下離心20min，去除沉淀；上清脫醇后，加入2倍體積的乙酸乙酯，分三次進(jìn)行萃取，所得有機(jī)相濃縮干燥，得粗提物干粉； (5)將粗提物干粉用常壓硅膠色譜進(jìn)行初步分離，首先將選出的流動(dòng)相加入到層析柱中，然后用自然沉降法將硅膠裝入20mm×300mm玻璃柱中；同時(shí)將0.2g試樣溶于乙酸乙酯中，然后加入樣品質(zhì)量5倍硅膠攪拌均勻，濃縮成干粉，用自然沉降法加到硅膠柱的上部；用優(yōu)選的流動(dòng)相(乙酸乙酯/甲醇/水＝170/10/5)進(jìn)行洗脫；自動(dòng)分步收集；逐管點(diǎn)樣進(jìn)行薄層分析，得到6組組分，其中第6組組分占總量的60％。
將第6組組分進(jìn)行化學(xué)成分鑒定成分分析采用氣/質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，GC/MS聯(lián)用儀的型號(hào)為島津GC/MS-QP2010，色譜柱型號(hào)為DB-5ms，長(zhǎng)30m，直徑0.25mm。測(cè)試的工作條件為先將溫度升到120℃，保持2min，然后以20℃/min的速度升到250℃保持20min。分流比為10∶1，進(jìn)樣口溫度為250℃。質(zhì)譜條件離子源溫度為250℃，電子能量是70ev，掃描范圍為20-650m/z。
鑒定結(jié)果分析得到色譜圖(
圖1)，從色譜圖看出，第6組物質(zhì)進(jìn)樣后出峰主要集中在保留時(shí)間3.625-19.117min范圍內(nèi)，共17個(gè)峰，對(duì)質(zhì)譜圖檢索和解析后得知其包括17個(gè)組分，其中相對(duì)含量大于2％的有6種組分(表1)，包括2-哌啶酮占14.02％，2-香豆?jié)M酮占47.10％，3-吡咯烷-2-基-丙酸占6.16％，六氫化-吡咯環(huán)[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮占21.05％，5，10-二乙氧基-2，3，7，8-4氫化-1H，6H-雙吡咯[1，2-a；1’，2’-d]吡嗪占2.782％，1，2-苯二甲酸，二異辛酯占3.69％，其余組分只占5.21％。其中2-香豆?jié)M酮占47.10％，說(shuō)明它是第6組物質(zhì)的主要成分。根據(jù)質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)照，這種組分與標(biāo)準(zhǔn)圖譜的符合度為98％(圖2)。由以上分析可知2-香豆?jié)M酮是該菌株的主要代謝產(chǎn)物。
表1第6組物質(zhì)經(jīng)GC/MS檢測(cè)的化學(xué)組分

實(shí)施例2 卵孢白僵菌(Beauveria tenella)CGMCC NO.2382的殺蟲(chóng)活性試驗(yàn) PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g、瓊脂20g、葡萄糖20g、蒸餾水1000ml。
供試?yán)ハx(chóng)為采自山西省靈丘縣西山礦物局林場(chǎng)的油松毛蟲(chóng)4-5齡健康幼蟲(chóng)。
孢子懸液的制備將供試菌株斜面培養(yǎng)后，用0.1％吐溫80無(wú)菌水配制成濃度為1.0×107個(gè)/ml的孢子懸液。
白僵菌孢子懸液對(duì)油松毛蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性試驗(yàn) 用濃度為1.0×107個(gè)/ml的孢子懸液感染油松毛蟲(chóng)5齡幼蟲(chóng)，每組30頭，設(shè)3重復(fù)和對(duì)照。對(duì)感染孢子懸液的油松毛蟲(chóng)5齡幼蟲(chóng)和空白對(duì)照組進(jìn)行觀察。感染組在第二、三天體重較前一天有所增加，經(jīng)觀察取食量與對(duì)照比變化不大；從第四天開(kāi)始，大部分幼蟲(chóng)取食量下降，個(gè)別幼蟲(chóng)停止取食，體重開(kāi)始下降；從第五天開(kāi)始，被感染組幼蟲(chóng)體重下降加快；第六天開(kāi)始有幼蟲(chóng)相繼死亡；第七天統(tǒng)計(jì)每組死亡蟲(chóng)數(shù)分別為19頭、15頭、20頭，平均死亡蟲(chóng)數(shù)為18.0頭。蟲(chóng)尸僵硬且放置幾天后長(zhǎng)出白色菌絲。對(duì)照組在試驗(yàn)觀察中幼蟲(chóng)的行為沒(méi)有異常變化，正常取食，體重有所上升，第7天每組死亡蟲(chóng)數(shù)分別為1頭、2頭、1頭，平均死亡蟲(chóng)數(shù)為1.3頭。蟲(chóng)尸沒(méi)有菌絲，也沒(méi)有僵硬現(xiàn)象。根據(jù)計(jì)算，白僵菌孢子懸液對(duì)油松毛蟲(chóng)的校正死亡率達(dá)到57.52％，用t-檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.01，說(shuō)明白僵菌孢子懸液對(duì)油松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)有極顯著的殺蟲(chóng)活性(表2)。
表2孢子懸液對(duì)油松毛蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性

權(quán)利要求
1、一種產(chǎn)2-香豆?jié)M酮的白僵菌，卵孢白僵菌(Beauveria tenella)CGMCC NO.2382。
2、一種制備2-香豆?jié)M酮的方法，其特征在于，包括如下步驟
(1)將保藏號(hào)為CGMCC NO.2382的卵孢白僵菌菌種接入斜面培養(yǎng)基，在溫度20-27℃，相對(duì)濕度60-85％下培養(yǎng)7-10天，得到斜面菌種；
(2)將斜面菌種在無(wú)菌條件下接入裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度20-27℃培養(yǎng)7-10天，得到種子液；
(3)將種子液接入裝有液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在溫度20-27℃培養(yǎng)7-10天，得到菌種發(fā)酵液；
所述的固體斜面培養(yǎng)基的組分和配比蛋白胨8-15g/L，酵母浸出膏8-15g/L，葡萄糖30-50g/L，瓊脂15-25g/L，蒸餾水定容；所述的液體培養(yǎng)基的組分和配比蛋白胨8-15g/L，酵母浸出膏8-15g/L，葡萄糖30-50g/L，蒸餾水定容；
(4)將培養(yǎng)好的菌種發(fā)酵液在5000r/min下離心15-30min，除去菌絲體，將上清液在45-50℃下濃縮至原體積的1/4-1/5，室溫下加入3倍體積95％乙醇，靜置24h-36h，4000r/min下離心10-20min，去除沉淀，上清液脫醇后，加入1.5-2.5倍體積的乙酸乙酯，萃取三次，所得有機(jī)相濃縮干燥，得粗提物干粉；
(5)將粗提物干粉用常壓硅膠色譜進(jìn)行分離，得到含有2-香豆?jié)M酮的物質(zhì)。
3、如權(quán)利要求2所述制備2-香豆?jié)M酮的方法，其特征在于，所述的固體斜面培養(yǎng)基的組分和配比蛋白胨10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水定容。
4、如權(quán)利要求2所述制備2-香豆?jié)M酮的方法，其特征在于，所述的液體培養(yǎng)基的組分和配比蛋白胨10g/L，酵母浸出膏10g/L，葡萄糖40g/L，蒸餾水定容。
5、如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)2-香豆?jié)M酮的白僵菌，可用于防治松毛蟲(chóng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)2-香豆?jié)M酮的白僵菌，卵孢白僵菌(Beauveria tenella)CGMCC NO.2382。并提供了利用該菌種制備2-香豆?jié)M酮的方法，步驟包括白僵菌發(fā)酵液制備，發(fā)酵液經(jīng)離心、萃取、干燥得粗提物干粉，用常壓硅膠色譜進(jìn)行分離，得到含有2-香豆?jié)M酮的物質(zhì)。本發(fā)明通過(guò)微生物發(fā)酵的方法制備得到2-香豆?jié)M酮，與化學(xué)合成的方法相比，方法簡(jiǎn)單，成本低，而且生產(chǎn)過(guò)程不產(chǎn)生污染。本發(fā)明所提供的卵孢白僵菌不僅可用于2-香豆?jié)M酮的提取，也可用于防治松毛蟲(chóng)。
文檔編號(hào)A01P7/04GK101302478SQ200810054719
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者謝映平, 樊金華, 薛皎亮, 李保珍 申請(qǐng)人:山西大學(xué)