一株根瘤菌及其在檸條育苗中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株根瘤菌及其在檸條育苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的楊凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)CCBAU01603，其保藏編號(hào)為CGMCC No.7895。本發(fā)明還保護(hù)所述菌株在促進(jìn)檸條生長(zhǎng)中的應(yīng)用、在檸條育苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種菌劑，為培養(yǎng)所述菌株得到的整個(gè)培養(yǎng)體系。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：（1）為生產(chǎn)上提供了生長(zhǎng)速度快速的檸條根瘤菌，添補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外缺乏快生型檸條根瘤菌的空白；（2）革新了傳統(tǒng)的檸條種植方式，增加了育苗并接種根瘤菌的工作，保證了檸條的結(jié)瘤率，促進(jìn)了檸條在荒漠環(huán)境中的健康成長(zhǎng)；（3）有利于在荒山、荒漠區(qū)以及道路綠化等過程中通過種植結(jié)瘤的檸條植株達(dá)到促進(jìn)生態(tài)恢復(fù)和保護(hù)生態(tài)環(huán)境的目的。CGMCC No.78952013.07.08
【專利說明】一株根瘤菌及其在檸條育苗中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株根瘤菌及其在檸條育苗中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 根瘤菌是一類能與豆科植物結(jié)瘤共生的固氮細(xì)菌。當(dāng)與合適的豆科植物共生時(shí)， 根瘤菌固定空氣中的氮?dú)鉃榘保瑥亩鵀槎箍浦参锾峁┑貭I(yíng)養(yǎng)，而豆科植物則通過光合作 用為根瘤菌提供碳水化合物和能量，兩者形成了很好的共生關(guān)系。
[0003] 由于根瘤菌與豆科植物之間存在著相互識(shí)別作用，且這種作用又受到地理環(huán)境和 土壤理化因子的影響，因此需要選育適合豆科植物且適應(yīng)環(huán)境的根瘤菌，才能達(dá)到兩者之 間互惠互利的共生效果。在從未種植過豆科植物的土壤內(nèi)種植豆科植物,需要接種合適的 根瘤菌才能保障豆科植物良好地生長(zhǎng)。
[0004] 檸條是一種很好的防風(fēng)固沙豆科植物，它在荒漠改良、生態(tài)保護(hù)、荒山改造中起著 重要的作用。檸條根系發(fā)達(dá)，入地深達(dá)數(shù)米以上，抗擊風(fēng)沙和沙埋的能力強(qiáng)。多年生的檸條 還可作為牛羊的飼料，檸條莖可編筐、造紙、制作復(fù)合板材或作為碳薪材料。
[0005] 由于檸條多在貧瘠的荒漠地區(qū)生長(zhǎng)，而通過人工施肥又存在著缺少肥源，施肥困 難等諸多問題，因此解決檸條在荒漠地區(qū)良好生長(zhǎng)的重要措施就是在種植初期使其與根瘤 菌結(jié)瘤，形成共生固氮體系，再移植到合適的種植區(qū)，通過合理的養(yǎng)護(hù)管理，就能達(dá)到提高 檸條的存活率、促進(jìn)檸條健康生長(zhǎng)，在荒漠綠化，改善生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮重要的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一株根瘤菌及其在檸條育苗中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)CCBAU01603,已于 2013 年 7月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 7895。楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)CCBAUO1603 簡(jiǎn)稱菌株 CCBAUO1603。
[0008] 本發(fā)明還保護(hù)菌株CCBAU01603在促進(jìn)檸條生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)菌株CCBAUO1603在檸條育苗中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還保護(hù)一種用于培養(yǎng)所述菌株CCBAUO1603的培養(yǎng)基（YIA培養(yǎng)基)，為采用 如下方法制備得到的培養(yǎng)基：取肌醇8-12g、酵母粉2-4g、MgS040. 1-0 . 3g、NaC10. 05-0. 15g、 K2HPO4O. 15-0. 35g和KH2PO4O. 15-0. 35g，溶于水并用定容到1000ml。所述YIA培養(yǎng)基具 體可為采用如下方法制備得到的培養(yǎng)基：取肌醇l〇g、酵母粉3g、MgSO 4O. 2g、NaClO. lg、 K2HPO4O. 25g和KH2PO4O. 25g，溶于水并用定容到1000ml。所述培養(yǎng)基的pH具體可為7· 0。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)一種菌劑，為培養(yǎng)菌株CCBAU01603得到的整個(gè)培養(yǎng)體系。
[0012] 所述菌劑具體可為采用如下方法制備得到的菌劑：（1)將菌株CCBAUO1603接種至 所述YIA培養(yǎng)基，28°C、160轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；（2)取步驟（1)的整個(gè)培養(yǎng)體系，每 1000毫升加入1毫升微量元素溶液，得到菌劑。所述微量元素溶液的制備方法具體如下： 取 Η3Β042· 86g、MnSO4L 81g、CuSO4 · 5Η200· 8g、ZnSO4O. 22g、H2MoO4O. 02g，溶于水并用定容至 1000ml。
[0013] 本發(fā)明還保護(hù)所述菌劑在促進(jìn)檸條生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還保護(hù)所述菌劑在檸條育苗中的應(yīng)用。應(yīng)用所述菌劑進(jìn)行檸條育苗的方法 具體如下：（1)用所述菌劑噴灑檸條種子，使根瘤菌吸附于種子表面；（2)育苗，使根瘤菌在 檸條根系上結(jié)瘤，形成結(jié)瘤幼苗；（3)幼苗的田間移栽；（4)田間管理，確保植株成活。室內(nèi) 及田間試驗(yàn)的結(jié)果均表明，應(yīng)用本發(fā)明提供的菌劑后，可顯著提高檸條的成活率和結(jié)瘤率， 并促進(jìn)檸條的生長(zhǎng)。
[0015] 本發(fā)明的發(fā)明人通過根瘤菌的分離、培養(yǎng)、遺傳、表型等研究,找到一株高效結(jié)瘤 固氮、且適應(yīng)鹽堿環(huán)境的檸條快生型根瘤菌。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：（1)為生產(chǎn)上提供了生長(zhǎng)速度 快速的檸條根瘤菌，添補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外缺乏快生型檸條根瘤菌的空白；（2)革新了傳統(tǒng)的檸條 種植方式，增加了育苗并接種根瘤菌的工作，保證了檸條的結(jié)瘤率，促進(jìn)了檸條在荒漠環(huán)境 中的健康成長(zhǎng)，獲得更多的氮素營(yíng)養(yǎng)；（3)通過本發(fā)明的實(shí)施，有利于在荒山、荒漠區(qū)及道 路綠化中等過程中通過種植結(jié)瘤的檸條植株達(dá)到促進(jìn)生態(tài)恢復(fù)和保護(hù)生態(tài)環(huán)境的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為播種45天后，每株植株的結(jié)瘤數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0017] 圖2為播種45天后，每株植株的根瘤鮮重統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0018] 圖3為播種45天后，每株植株的地上部分干重統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0019] 圖4為播種45天后，每株植株的地上部分株高統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置15次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果做 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。朽 1條(學(xué)名：Caragana microphylla;俗稱小葉錦雞兒）：內(nèi)蒙古鄂爾多斯市碧 森種業(yè)有限公司。沙土：采集自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市中科院沙地生態(tài)試驗(yàn)站。
[0021] 實(shí)施例1、根瘤菌的獲得和鑒定 [0022] 一、根瘤菌的獲得
[0023] 2011年7月從內(nèi)蒙古鄂爾多斯中科院野外生態(tài)試驗(yàn)站的沙地中采集沙土樣品， 帶回中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)根瘤菌研究中心。將表面消毒的檸條種子種植到采集的沙土中，一個(gè) 月后植株結(jié)瘤固氮。將根瘤取下，經(jīng)表面消毒后，用YIA培養(yǎng)基分離其中的根瘤菌。經(jīng)純 化并經(jīng)后續(xù)的鑒定、回接結(jié)瘤驗(yàn)證后，將一株在YIA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快速的菌株命名為 CCBAUO1603,該菌株為對(duì)于檸條具有高效結(jié)瘤固氮的作用。
[0024] 二、根瘤菌的鑒定
[0025] 革蘭氏染色法染色結(jié)果為陰性；不產(chǎn)生芽孢。生長(zhǎng)速度快于慢生型根瘤菌，在?Α 液體培養(yǎng)基及28°C條件下培養(yǎng)時(shí)，代時(shí)為6. 08小時(shí)。
[0026] 菌株CCBAU01603的部分測(cè)序結(jié)果見序列表的序列1，與楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)同源性最高。
[0027] 綜合以上鑒定結(jié)果，菌株CCBAU01603為楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)。
[0028] 三、根瘤菌的保藏
[0029] 楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)CCBAU01603,已于 2013 年 7 月 8 日保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)），保藏號(hào)為CGMCC No. 7895。楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense) CCBAUO1603 簡(jiǎn)稱菌株 CCBAUO1603。
[0030] 實(shí)施例2、菌株CCBAU01603的應(yīng)用
[0031] 一、培養(yǎng)基的制備
[0032] YIA培養(yǎng)基，全稱為"Yeast-Inositol-Agar"培養(yǎng)基，中文全稱為"酵母粉-肌 醇-瓊脂"培養(yǎng)基。
[0033] YIA液體培養(yǎng)基的制備方法：取肌醇10g、酵母粉3g、MgSO4O. 2g、NaClO. lg、 K2HPO4O. 25g和KH2PO4O. 25g溶于蒸餾水，并用蒸餾水定容到1000ml ;ρΗ7· 0。
[0034] YIA固體培養(yǎng)基的制備方法：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，每升加入15_20g瓊脂粉。
[0035] 常規(guī)的用于根瘤菌的培養(yǎng)的培養(yǎng)基為YMA培養(yǎng)基（全稱為 "Yeast-Mannitol-Agar"培養(yǎng)基；中文全稱為"酵母粉-甘露醇-瓊脂"培養(yǎng)基）。YIA與 YM之間的差別僅在于碳源種類的不同，YIA培養(yǎng)基中碳源為肌醇，YM培養(yǎng)基中，碳源為甘 露醇。
[0036] 本發(fā)明的實(shí)施例中使用YIA培養(yǎng)基，因?yàn)樵赮IA培養(yǎng)基中，肌醇充當(dāng)根瘤菌生長(zhǎng)的 碳源，而豆科植物根系又可分泌此物質(zhì)，同時(shí)肌醇還可做為根瘤菌與植物之間的分子對(duì)話 的信號(hào)分子以及根瘤菌生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子。YMA培養(yǎng)基中，甘露醇僅做為根瘤菌生長(zhǎng)的碳源， 未見報(bào)到有其它功能。如果未能得到肌醇，可以使用YM培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株CCBAU01603,菌株 也能生長(zhǎng)良好。
[0037] 二、根瘤菌菌劑的制備
[0038] 1、菌株活化
[0039] 將4°C冰箱保存于YIA固體斜面上的菌株CCBAU01603轉(zhuǎn)接到新鮮配制的?Α固體 培養(yǎng)基平板上，劃線出單菌落。4°C冰箱保存時(shí)，保存時(shí)間不應(yīng)長(zhǎng)于3個(gè)月。
[0040] 2、擴(kuò)大培養(yǎng)
[0041] 用滅菌后的接種環(huán)挑取上述平板上的單菌落一到兩環(huán)，接種至200ml滅菌后的 YIA液體培養(yǎng)基，28°C、160轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。
[0042] 3、根瘤菌菌劑的獲得
[0043] 取步驟2的整個(gè)培養(yǎng)體系，每1000毫升的上述培養(yǎng)體系加入1毫升滅菌后的微量 元素溶液，得到根瘤菌菌劑。
[0044] 微量元素溶液的制備方法：取 Η3Β042· 86g、MnSO4L 81g、CuSO4 · 5Η200· 8g、 ZnSO4O. 22g、H2MoO4O. 02g，溶于蒸餾水，并用蒸餾水定容到1000ml。
[0045] 培養(yǎng)體系與微量元素與微量元素溶液混合均勻可直接使用（本發(fā)明中直接使用）， 如短期存放，最好4-8°C保存，也可存在放于通風(fēng)陰涼的地方，勿在陽光下曝曬，建議在1-2 周內(nèi)使用完畢。
[0046] 三、根瘤菌菌劑的應(yīng)用
[0047] 1、苗床整理
[0048] 第一組：將干濕度合適的沙土 (水份控制在10%以下）過10目的篩子，然后均勻鋪 到苗床上，苗床的深度以30-50厘米為宜。
[0049] 第二組：將直徑為0. 75-1. Omm的蛭石均勻鋪到苗床上，苗床的深度以30-50厘米 為宜。
[0050] 2、用根瘤菌菌劑噴灑檸條種子
[0051] 實(shí)驗(yàn)時(shí)間為4月初至4月中旬，實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為北京中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)根瘤菌研究中心。
[0052] 挑選健康、飽滿、粒度大小一致的檸條種子，置于干凈塑料盆中，在陰涼處用噴霧 器將步驟二制備得到的根瘤菌菌劑噴灑于檸條種子表面，確保每粒種子都粘上菌劑。
[0053] 實(shí)際應(yīng)用中，也可將根瘤菌菌劑搖勻后，取適量倒到種子表面，然后攪拌均勻。
[0054] 粘有根瘤菌菌劑的種子不宜在陽光下暴曬。
[0055] 3、播種
[0056] 第一組實(shí)驗(yàn)組（Sandy_01603組）：將步驟2中噴灑了根瘤菌菌劑的種子均勻播灑 到步驟1制備的第一組苗床上，每粒種子占據(jù)5cmX 5cm的面積，種子表面均勻覆蓋一層 l-2cm厚的濕度為20%左右的過10目篩后的沙子，將窗紗蓋到苗床上，并與苗床保持20cm 的距離，防止鳥兒刨食，再在苗床上噴灑適量的水份。
[0057] 第一組對(duì)照組（Sandy_CK組):將檸條種子(未進(jìn)行步驟2的處理)均勻播灑到步驟 1制備的第一組苗床上，每粒種子占據(jù)5cmX 5cm的面積，種子表面均勻覆蓋一層l-2cm厚的 濕度為20%左右的過10目篩后的沙子，將窗紗蓋到苗床上，并與苗床保持20cm的距離，防 止鳥兒刨食，再在苗床上噴灑適量的水份。
[0058] 第二組實(shí)驗(yàn)組（Vml_01603組）：用第二組苗床代替第一組苗床，且用"種子表面均 勻覆蓋一層l-2cm厚的粒徑為0. 75-1. OOmm的蛭石"代替"種子表面均勻覆蓋一層l-2cm厚 的濕度為20%左右的過10目篩后的沙子"，其它共第一組實(shí)驗(yàn)組。
[0059] 第二組對(duì)照組（Vml_CK組):用第二組苗床代替第一組苗床，且用"種子表面均勻覆 蓋一層l-2cm厚的粒徑為0. 75-1. OOmm的蛭石"代替"種子表面均勻覆蓋一層l-2cm厚的 濕度為20%左右的過10目篩后的沙子"，其它共第一組對(duì)照組。
[0060] 4、育苗
[0061] 播種后3-5天即可出苗，根據(jù)天氣情況適時(shí)澆水，育苗時(shí)間為1. 5-2個(gè)月，以45天 為宜，以形成結(jié)瘤苗。結(jié)瘤苗形成后，可以統(tǒng)計(jì)結(jié)瘤數(shù)目、根瘤鮮重、地上部分干重、地上部 分株1?、葉片葉綠素含量等指標(biāo)。
[0062] 播種45天后，每株植株的結(jié)瘤數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1 (每組統(tǒng)計(jì)15株植株)，每株植 株的根瘤鮮重（g)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖2 (每組統(tǒng)計(jì)15株植株)，每株植株的地上部分干重（g)統(tǒng) 計(jì)結(jié)果見圖3 (每組統(tǒng)計(jì)15株植株)，每株植株的地上部分株高（cm)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4 (每組 統(tǒng)計(jì)15株植株)。圖1至圖4中，每個(gè)柱子上的橫線為標(biāo)準(zhǔn)差。橫線上面的字母(即a，b，c，d 及不同組合)代表不同處理的差異是否顯著（P=〇. 05水平），如果為不同的字母則表示處理 間有顯著差異，如果有相同的字母則表示處理間的差異不顯著。
[0063] 結(jié)果表明，以蛭石為基質(zhì)時(shí)，施加根瘤菌菌劑后，植株的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)(包括結(jié) 瘤數(shù)目、根瘤鮮重、地上部分株高、地上部分干重）均明顯高于不施加根瘤菌菌劑的對(duì)照處 理，且差異顯著。結(jié)果表明，以沙土為基質(zhì)時(shí)，施加根瘤菌菌劑后，植株的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo) (包括結(jié)瘤數(shù)目、根瘤鮮重、地上部分干重)均高于不施加根瘤菌菌劑的對(duì)照處理，且差異顯 著。結(jié)果表明，以沙土為基質(zhì)時(shí)，施加根瘤菌菌劑后，植株的地上部分株高高于不施加根瘤 菌菌劑的對(duì)照處理。
[0064] 5、田間移植與管理
[0065] 將完成育苗的幼苗用鐵鍬小心挖出，勿傷及根系，將幼苗放入合適的容器(如塑料 袋）中，保持一定的濕度，盡快移植到田間。田間種植時(shí)，可以行播，每穴3-5株，穴間距為1 米。移植后要根據(jù)情況及時(shí)澆水，以保證植株成活。植株成活后，第一年要防止牲畜啃食， 如果植株得病要及時(shí)進(jìn)行防治，禁止采伐3年后方可解除圍封禁牧。
【權(quán)利要求】
1. 楊凌根瘤菌（Rhizobium yanglingense)CCBAU01603,其保藏編號(hào)為 CGMCC No.7895。
2. 權(quán)利要求1所述菌株在促進(jìn)檸條生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求1所述菌株在檸條育苗中的應(yīng)用。
4. 用于培養(yǎng)權(quán)利要求1所述菌株的培養(yǎng)基，為采用如下方法制備得到的培養(yǎng)基： 取肌醇 8-12g、酵母粉 2-4g、MgS040. 1-0 . 3g、NaClO. 05-0. 15g、Κ2ΗΡ040· 15-0. 35g 和 ΚΗ2Ρ040· 15-0. 35g，溶于水并用定容到1000ml。
5. -種菌劑，為培養(yǎng)權(quán)利要求1所述菌株得到的整個(gè)培養(yǎng)體系。
6. 權(quán)利要求5所述菌劑在促進(jìn)檸條生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求5所述菌劑在檸條育苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104277992SQ201310292237
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月12日
【發(fā)明者】陳文峰, 崔清國(guó), 冀照君, 嚴(yán)慧, 陳文新 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 中國(guó)科學(xué)院植物研究所