用于大序列細胞劃痕遷移觀測的微流控芯片及其觀測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，尤其設及一種用于大序列細胞劃痕遷移觀測的微流控 忍片及其觀測方法。
【背景技術】
[0002] 細胞遷移參與了組織器官形成、組織損傷修復等重要生理過程；細胞遷移功能失 調，則會導致腫瘤細胞侵襲及轉移。通過促進或抑制細胞遷移可影響某些疾?。ㄈ毖酝汀?血管疾病、腫瘤）的發(fā)生發(fā)展與轉歸，因此研究細胞遷移具有重要的理論意義與實用價值。
[0003] 目前，傳統(tǒng)的測定細胞遷移方法W細胞趨化小室法度oyden化amber)和劃痕法最 常用。前者由上、下兩室組成，中間W微孔濾膜隔開。趨化因子加入下室，形成濃度梯度，細 胞接種在上室，受趨化因子濃度梯度的影響，穿過膜上的微孔移動到另一側。之后，細胞固 定、染色和計數，W此確定其遷移能力。后者是用移液槍頭在融合細胞上劃出一道劃痕，觀 察細胞向劃痕區(qū)域的遷移情況，來判斷細胞的遷移能力。
[0004] 微流控忍片（微流控技術），是微加工技術的產物。由于其通道尺寸與哺乳類細胞 線性尺寸相比擬，多維網絡結構與生理狀態(tài)下細胞的空間特征相接近，已被廣泛用于細胞 生物學研究。Nie等于2007年提出一種利用層流形成細胞劃痕的微流控忍片，見參考文獻 1。 化eng等于2008年提出一種直流電結合化學表面修飾實現細胞遷移的方法，見參考文獻 2。 與傳統(tǒng)方法比較，微流控技術具有尺寸可比擬，可控性好，精度高等優(yōu)點。該些研究均說 明了通過微流控技術研究細胞遷移的可行性。 陽〇化]在實現本發(fā)明的過程中，申請人發(fā)現現有的基于微流控的劃痕技術，通量普遍較 低，針對一個劃痕實驗的成本較高，難W大范圍應用。
[0006] 參考文獻1 :0n-Chip cell migration assay using microfluidic channels， Biomaterials 28(2007)4017-4022；
[0007] 參考文獻2 :An automatic and quantitative on-chip cell migration assay using self-assembled monolayers combined with real-time cellular impedance sensing，L曰b On曰Chip-Mini曰turis曰tion for chemistry，biology&bioengineering， Volume 8,Number 6,June 2008,化ge 837-992。

【發(fā)明內容】
陽00引（一）要解決的技術問題
[0009] 鑒于上述技術問題，本發(fā)明提供了一種用于大序列細胞劃痕遷移觀測的微流控忍 片及其觀測方法，W實現大序列細胞劃痕遷移觀測實驗。
[0010] (二）技術方案
[0011] 根據本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于大序列細胞劃痕遷移觀測的微流控忍 片。該微流控忍片包括：基底W及固定于基底上方的功能層；其中，在功能層上形成功能小 室陣列，在該功能小室陣列中各功能小室底部基底部分的上表面形成有電性隔離的第一電 極和第二電極。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明微流控忍片中，第一電極為劃痕電極，第二電極為加電電極，劃痕 電極上修飾具有抗蛋白吸附功能基團的分子，功能小室內具有細胞懸液；具有抗蛋白吸附 功能基團的分子阻止細胞在劃痕電極上吸附；當加電電極和劃痕電極之間是加正向電壓 時，抗蛋白吸附的分子從劃痕電極上脫離，細胞能在劃痕電極上吸附。
[0013] 根據本發(fā)明的再一個方面，還提供了一種利用上述微流控忍片進行細胞遷移觀測 的方法。該方法包括：步驟S202:用膜蛋白酶消化細胞，并用培養(yǎng)基重懸，并將懸浮狀態(tài)的 細胞接種至微流控忍片的功能小室；；步驟S204 :培養(yǎng)功能小室內的細胞，直至細胞在劃痕 電極W外的地方貼壁生長；步驟S206 :在劃痕小室的劃痕電極和加電電極之間施加電壓， 并持續(xù)預設時間，使具有抗蛋白吸附功能基團的分子從劃痕電極上脫離；步驟S208 :移除 含有抗蛋白吸附分子的培養(yǎng)基，更換成含有實驗需要的趨化因子的培養(yǎng)基，拍照記錄預設 時間后細胞向劃痕電極遷移的情況。
[0014] (S)有益效果
[0015] 從上述技術方案可W看出，本發(fā)明用于大序列細胞劃痕遷移觀測的微流控忍片及 其觀測方法具有W下有益效果：
[0016] (1) 一次最多可W實現384組平行實驗，通量高，從而大大降低了實驗成本，并且， 理論上來講，忍片可W重復利用，使用過的忍片經過清洗和無菌處理后，可W再次進行硫醇 修飾，投入到劃痕實驗中，運又再次大大降低了實驗成本；
[0017] 似用電極控制劃痕邊界，用加電壓的方法去除具有抗蛋白吸附功能基團的分子， 可W保證各個劃痕小室間劃痕一致，且細胞和基質在此過程中不會受損，因此遷移結果精 準可信。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明用于大序列細胞劃痕遷移觀測的微流控忍片設計原理的示意圖；
[0019] 圖2為根據本發(fā)明實施例用于大序列細胞劃痕遷移觀測的微流控忍片的結構示 意圖；
[0020] 圖3為圖2所示微流控忍片制備方法的流程圖；
[0021] 圖4為圖3所示微流控忍片制備方法中執(zhí)行各步驟之后的劃痕小室的剖面圖；
[0022] 圖5為圖2所示微流控忍片觀測方法的流程圖；
[0023] 圖6為圖5所示微流控忍片觀測方法中執(zhí)行各個步驟之后的劃痕小室內細胞狀態(tài) 的不意圖。
【具體實施方式】
[0024] 在對本發(fā)明進行介紹之前，首先對其設計原理進行說明。有一種功能基團為聚乙 二醇長鏈（PEG)的硫醇分子。PEG功能基團具有抗蛋白吸附的特性。因此，如果將具有PEG 功能基團的硫醇分子修飾到金屬電極上的話，就可W阻止細胞吸附在電極表面。并且，在一 定電壓下，硫醇分子還可W從金屬電極上脫離，從而細胞又可W在電極表面吸附生長了。
[0025] 本發(fā)明將上述設計原理、微流控忍片技術與劃痕實驗相結合，提供了一種能夠高 通量的，可W實時觀察細胞遷移的微流控忍片，并同時給出該微流控忍片的觀測方法。
[0026] 為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，W下結合具體實施例，并參照 附圖，對本發(fā)明進一步詳細說明。
[0027] 在本發(fā)明的一個示例性實施例中，提供了一種用于大序列細胞劃痕遷移觀測的微 流控忍片。請參照圖2,本實施例用于大序列細胞劃痕遷移觀測的微流控忍片包括：基底W 及固定于基底上方的功能層。
[0028] 本實施例中，基底采用透明玻璃。而在本發(fā)明其他實施例中，還可W采用有機塑 料、Al2〇3片、MgO片作為基底制作微流控忍片。
[00巧]本實施例中，功能層由聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，簡稱PDM巧制 作，厚度為5mm，其上形成有劃痕小室陣列，共16行24列共384個正方形的劃痕小室。
[0030] 請參照圖2中C圖，該劃痕小室為向上開口的正方形小室，其邊長3. 7mm，相鄰兩劃 痕小室的中屯、間距4. 5mm，與標準384孔板尺寸一致。在結構上，該微流控忍片與傳統(tǒng)多孔 板技術兼容，完全適應現有的多孔板平臺。
[0031] 可W理解的是，劃痕小室的橫截面形狀不局限于正方形，其也可W是長方形、圓 形，Ξ角形等其他規(guī)則或不規(guī)則圖形。并且，劃痕小室的數量也不局限于384,也可W是96、 24、12、6等其他標準規(guī)格多孔板的孔的數量，或者是設計者規(guī)定的其他數量。
[0032] 如圖2中C所示，每一劃痕小室底