一種產(chǎn)纖溶酶枯草芽孢桿菌及發(fā)酵方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)纖溶酶枯草芽孢桿菌及發(fā)酵方法和 應(yīng)用，本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌分離篩選至豆豉，具有高產(chǎn)豆豉纖溶酶的能力，可用于預(yù) 防或緩解血栓性疾病的功能性食品或藥品的開發(fā)中。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾?。╟ardiovasculardisease，CVDs)，如急性心肌梗死、缺血性心臟病和 高血壓是世界上人類死亡的主要原因之一。據(jù)2001年世界衛(wèi)生組織報(bào)告，每年約有1700 萬人死于CVDs，到2020年，因CVDs而導(dǎo)致的每年死亡人數(shù)將增至2500萬。在不同類型的 CVDs中，血栓性疾病已成為威脅人類健康的最主要的病因之一。因此，如何有效地預(yù)防和治 療血栓性疾病，已引起國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界和科技界的高度重視。
[0003] 治療血栓性疾病的方法主要有外科手術(shù)、保守療法和溶栓療法三種，其中溶栓療 法以纖溶酶作為溶栓劑，使血管再通，治療費(fèi)用較低，是目前治療血栓性疾病最為有效和可 靠的手段。相比臨床上使用的組織型纖溶酶原激活劑（t-PA)、尿激酶（UK)和鏈激酶（SK)等 溶栓藥物，食品來源的纖溶酶，如納豆激酶和豆豉纖溶酶不僅血栓溶解能力強(qiáng)，而且具有安 全無毒、不引起內(nèi)出血、生產(chǎn)成本低、在胃腸里的穩(wěn)定性好以及在體內(nèi)的半衰期長等優(yōu)點(diǎn)。 豆豉是我國傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，有上千年的歷史，制作方式比日本的納豆復(fù)雜。據(jù)中國藥 典記載：豆豉具有開胃增食，消積化滯，祛風(fēng)散寒以及預(yù)防心血管疾病等功效，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)， 豆豉中的纖溶酶活性比納豆來源的納豆激酶活性更高。近年來，科研工作者相繼從中國的 豆豉、日本的納豆、韓國的豆醬和印尼的天培等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中發(fā)現(xiàn)并獲得產(chǎn)纖溶酶的菌 株。然而，目前國內(nèi)的纖溶酶產(chǎn)品活性普遍偏低。因此，從傳統(tǒng)的發(fā)酵食品中分離篩選高活 性的纖溶酶菌株，并對其發(fā)酵方法進(jìn)行研究，可為預(yù)防或治療血栓性疾病功能性食品或藥 品的開發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)，具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽抱桿菌DC27,該菌株具有尚廣?妓纖溶酶的特 性，安全無毒，可用于預(yù)防或治療血栓性疾病功能性食品或藥品的開發(fā)，該菌株已于2015 年9月23日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分類命名：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)DC27,保藏編號：CCTCCNO:M2015573,地址：中國武漢武漢大學(xué)。
[0005] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵方法，方法簡 單，易行，利用本發(fā)明提供的發(fā)酵方法，采用50L發(fā)酵罐所得發(fā)酵液中的纖溶酶活力可達(dá) 4506IU/mL。
[0006] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供了枯草芽孢桿菌DC27在制備纖溶酶中的應(yīng)用， 所述的應(yīng)用包括利用該菌株生產(chǎn)的纖溶酶制備各種目前市場上流通的含有纖溶酶的產(chǎn)品。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0008] -種枯草芽孢桿菌DC27,其篩選過程如下：
[0009] 1)利用初篩培養(yǎng)基分離和篩選傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中的芽孢菌，根據(jù)平板上的透明圈和 菌落大小的直徑的比值來確定酶活較高的菌株。
[0010] 初篩培養(yǎng)基：酪蛋白0.4%，NaCl 0.5%，瓊脂2%。
[0011] 2)利用復(fù)篩培養(yǎng)基將初篩獲得的菌株進(jìn)行復(fù)篩，通過纖溶酶活性測定和在血瓊脂 培養(yǎng)基上的溶血性試驗(yàn)選擇纖溶活力高且安全的菌株。
[0012]復(fù)篩培養(yǎng)基：葡萄糖1%，大豆蛋白胨1%，Na2HP04 0 . 2%，NaH2P04 0. 1%，CaCl2 0· 02%，MgS04 0· 05%，ρΗ7· 0,115Γ滅菌15min。
[0013] 血瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母膏0. 3%，NaCl5%，Na2HP04 0 . 5%，甘露醇1%， 新鮮的人血5%~10%，瓊脂1.5%，結(jié)晶紫10ppm，pH8.0。
[0014] 3)最后篩選到一株纖溶酶酶活力較高且安全的菌株DC27,通過形態(tài)學(xué)、生理生化 鑒定和16SrRNA的分子鑒定初步確定為枯草芽孢桿菌，再根據(jù)特異PCR進(jìn)一步確定為枯草 芽孢桿菌。該菌株已于2015年9月23日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分類命 名：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)DC27,保藏編號：CCTCCNO:M2015573。
[0015] 枯草芽孢桿菌DC27的形態(tài)特征：DC27在LB平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與芽孢桿菌 相似，為圓形，邊緣整齊，表面有褶皺，呈乳白色，半透明，有粘性。挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色 鏡檢，光學(xué)顯微鏡鏡下細(xì)胞形態(tài)為桿狀，革蘭氏染色為陽性，產(chǎn)芽孢，芽孢橢圓形，中生或近 中生。
[0016] DC27的生理生化特征：見表1。
[0017] 表1. DC27的生理生化特征
[0018]
[0019]
[0020] 注：" + "表示生理生化反應(yīng)（或革蘭氏染色）陽性；表示表示生理生化反應(yīng) (或革蘭氏染色）陰性；"d"表示11% -89%菌株為陽性；"ND"表示未測定。
[0021] 特異PCR:
[0022] 采用枯草芽孢桿菌的特異引物（上游引物為5'-CAGGCTCACACTTTGTCTTG-3'，下游 引物為5 '-TGAACACAGTCCTGGGTTAG-3 '），以枯草芽孢桿菌為陽性對照，進(jìn)行菌落PCR，PCR程 序?yàn)椋?4°C預(yù)變性10min，94°C變性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸2min，30個(gè)循環(huán)，72°C延 伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0023] 枯草芽孢桿菌DC27在搖瓶中的液體發(fā)酵方法包括：
[0024] 將處于對數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌DC27種子液以2% (體積比）的接種量接種到 液體發(fā)酵培養(yǎng)基（已滅菌）中，轉(zhuǎn)速170r/min，裝液量40mL/250mL，在37°C培養(yǎng)72h，發(fā)酵 液上清酶活可達(dá)到3185IU/mL。
[0025] 所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉3%、大豆蛋白胨2%、Na2HP04 0 . 2%、NaH2P04 0·l%、CaCl2 0.02%、MgS04 0 . 05%，ρΗ8·0,115Γ滅菌 20min。
[0026] 枯草芽孢桿菌DC27在50L發(fā)酵罐中的液體發(fā)酵方法包括：
[0027] 將處于對數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌DC27種子液以2% (體積比）的接種量接種到 液體發(fā)酵培養(yǎng)基（已滅菌）中，發(fā)酵罐進(jìn)氣口壓力〇· 25MPa，出氣口壓力0· 05MPa，攪拌速率 200r/min，裝液量30L/50L，在37°C培養(yǎng)36h，發(fā)酵液上清酶活可達(dá)到4506IU/mL。
[0028] 所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉3%、大豆蛋白胨2%、Na2HP04 0 . 2%、NaH2P04 0·l%、CaCl2 0.02%、MgS04 0 . 05%，ρΗ8·0,115Γ滅菌 20min。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0030] 1)本發(fā)明的枯草芽孢桿菌DC27來源于豆豉中，菌株的安全性高；
[0031] 2)本發(fā)明的初篩培養(yǎng)基選用酪蛋白培養(yǎng)基，配方簡單，結(jié)果展示明顯，縮短篩選時(shí) 間；
[0032] 3)本發(fā)明篩選的枯草芽孢桿菌DC27菌株的初始酶活與現(xiàn)有菌株相比酶活較高， 安全無毒，利于改造為更為優(yōu)良的菌株；
[0033] 4)本發(fā)明篩選的枯草芽孢桿菌DC27產(chǎn)酶量大，采用搖瓶發(fā)酵纖溶酶活力可達(dá) 3185IU/mL，采用50L發(fā)酵罐可達(dá)4506IU/mL，是目前已知的豆豉纖溶酶酶活最高的菌株，而 且培養(yǎng)中所用原料廉價(jià)，大型發(fā)酵周期短（36h)，利于企業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)，在預(yù)防或治療血 栓性疾病的功能性食品或藥品開發(fā)方面具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0034] 圖1為?妓中的廣蛋白酶菌株在酷蛋白平板上的活力不意圖。
[0035] 圖2為一種枯草芽孢桿菌DC27在LB平板上的菌落形態(tài)示意圖。
[0036] 圖3為一種枯草芽孢桿菌DC27在纖維蛋白平板上的活力示意圖。
[0037] 圖4為一種枯草芽孢桿菌DC27菌體在光學(xué)顯微鏡下的革蘭氏染色照片示意圖 (1000Χ)。圖5為尿激酶酶活與透明圈面積呈線性關(guān)系示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 實(shí)施例1 :
[0039] 一種枯草芽孢桿菌DC27的獲得：
[0040] 1)初篩
[0041] 從重慶市市售的5個(gè)豆豉樣品中各取lg豆豉，加入到盛有4~6顆玻璃珠的100mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，150r/min，37°C的搖床上振蕩20min，然后于80°C水浴lOmin后， 4000r/min離心5min。收集上清液，取lmL處理液加入9mL無菌蒸餾水分別稀釋5個(gè)梯度 (10 \ 10 2, 10 3, 10 4, 10 5)，分別吸取0.lmL涂布于酪蛋白初篩培養(yǎng)基平板上，37°C倒置培養(yǎng) 18h后取出，觀察平板，挑取初篩平板上透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株，轉(zhuǎn)接到LB平板上進(jìn)行劃線純培養(yǎng)，將得到的純培養(yǎng)菌株接種到LB斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)24h， 于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩＝?jīng)初篩培養(yǎng)基初篩，篩選出36株疑是產(chǎn)豆豉纖溶酶高活性的菌株。
[0042] 初篩培養(yǎng)基：酪蛋白0. 4%，NaCl0. 5%，瓊脂2%。
[0043] 2)復(fù)篩
[0044] 將初篩后保存于斜面上的菌株取一環(huán)接種到種子液，培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)接到裝有50mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，接種量為2%，在180r/min，37°C的搖床上培養(yǎng)72h，將發(fā)酵 液于4000r/min離心lOmin。采用纖維蛋白平板法進(jìn)行豆豉纖溶酶酶活的測定。將纖維平 板置于37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后觀察溶菌圈的大小，用游標(biāo)卡尺測量溶解