一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2，3-丁二醇是一個重要的生物基四碳平臺化合物，廣泛應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥、燃料及航空航天等多個領(lǐng)域。2，3- 丁二醇經(jīng)脫水反應(yīng)可以生產(chǎn)1，3- 丁二烯，I, 3- 丁二烯可用于合成橡膠、ABS樹脂及SBS彈性體等。由于2，3- 丁二醇冰點(diǎn)低達(dá)_60°C，因此可以用作抗凍劑。2，3- 丁二醇還可以通過脫氫反應(yīng)生成3-羥基丁酮和雙乙酰，它們具有令人愉快的乳香香味，是食品工業(yè)中常用的調(diào)香劑。2，3-丁二醇脫氫還可以生產(chǎn)甲基乙基酮，它是一種燃料添加劑，燃燒值比乙醇還要高，同時甲基乙基酮還可以用作樹脂和涂料的溶劑。2，3-丁二醇燃燒熱值達(dá)到27198J/g，和乙醇(29055J/g)相當(dāng)，并且具有較高的辛烷值，是一種潛在的高價值航空燃料添加劑。
[0003]2，3- 丁二醇生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩大類，化學(xué)法主要是在高溫、高壓條件下，將石油裂解時得到的四碳類碳?xì)浠衔锼猱a(chǎn)生2，3-丁二醇，工藝條件要求高，隨著石油資源的日益消耗和環(huán)境問題的惡化，這種化學(xué)合成工藝將逐漸被淘汰。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2，3-丁二醇由于其原料來源方便、操作工藝簡單、環(huán)境友好等一系列優(yōu)點(diǎn)，已引起人們的廣泛關(guān)注。目前，已經(jīng)報道的產(chǎn)2，3-丁二醇菌株主要集中在Klebsiella、Enterobacter、Serratia、Bacillus 等菌屬的菌株(Ji XJ et al.Microbial2,3-butaned1l product1n:A state-of-the-art review.B1technology Advances29 (2011): 351 - 364)，其中產(chǎn)率較高的菌種是 Klebsiella pneumoniae、Klebsiellaoxytoca、Serratia marcescens，但這兩類菌都是條件致病菌，不宜工業(yè)化推廣?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是公認(rèn)的安全性菌株，是工業(yè)發(fā)酵中常用生產(chǎn)菌株。利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)2，3- 丁二醇也有報道(饒志明等，一株環(huán)境安全的以葡萄糖為底物產(chǎn)2，3- 丁二醇枯草芽抱桿菌的選育，中國專利，CN101851598A, 2010 ；R.Biswas et al.Enhancedproduct1n of 2,3-butaned1l by engineered Bacillus subtilis.Appl Microb1lB1technol (2012)94:651 - 658)，但產(chǎn)率與 K.pneumoniae、S.marcescens 等菌株相比產(chǎn)率較低，沒有競爭優(yōu)勢。提供高效安全的生產(chǎn)2，3- 丁二醇的菌株及發(fā)酵工藝，是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員面臨的主要問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法。
[0005]發(fā)明人曾經(jīng)公開從自然環(huán)境中篩選到的一株產(chǎn)3-羥基丁酮生產(chǎn)菌株Bacillussubtilis SFA-H43(趙祥穎等.一株產(chǎn)3-羥基丁酮的芽孢桿菌及其應(yīng)用.中國專利.CN103333842B, 2015)，利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮，當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度耗盡后繼續(xù)培養(yǎng)3-羥基丁酮的產(chǎn)率會增加10-20%。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，菌株SFA-H43在利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵3-羥基丁酮的過程中，同時伴有2，3- 丁二醇產(chǎn)生，2，3- 丁二醇和3-羥基丁酮可以相互轉(zhuǎn)化，發(fā)酵前期產(chǎn)物以2，3- 丁二醇的為主，發(fā)酵后期2，3- 丁二醇逆轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酮，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖耗盡后，2，3-丁二醇仍可繼續(xù)轉(zhuǎn)化生成3-羥基丁酮，使3-羥基丁酮產(chǎn)率繼續(xù)增加(見附圖1)。此外，發(fā)明人通過對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵過程的工藝參數(shù)的調(diào)整，實(shí)現(xiàn)了利用菌株SFA-H43轉(zhuǎn)化葡萄糖大量積累2，3- 丁二醇的結(jié)果O
[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種枯草芽孢桿菌CCTCC No:M 2013181在發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇主產(chǎn)物中的應(yīng)用，本發(fā)明所使用的菌株Bacillus subtilis SFA-H43已經(jīng)在申請人以往申請的專利中公開(一株產(chǎn)3-羥基丁酮的芽孢桿菌及其應(yīng)用，授權(quán)專利號:ZL2013 10289934.7);本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇主產(chǎn)物是指代謝產(chǎn)物以2，3-丁二醇占主要比例。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CCTCCNo:M 2013181以葡萄糖為原料高產(chǎn)2，3-丁二醇的方法。
[0008]優(yōu)選的，發(fā)酵結(jié)束時控制發(fā)酵液中的葡萄糖濃度在5g/L以上；
[0009]優(yōu)選的，控制發(fā)酵液中的葡萄糖濃度為當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度降至0-10g/L時結(jié)束發(fā)酵，或當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖濃度低于10g/L時，通過分次補(bǔ)加或流加的方式向發(fā)酵罐中補(bǔ)加葡萄糖。
[0010]本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下:
[0011]⑴種子培養(yǎng)
[0012]該菌株在4°C冰箱保藏，使用前劃線于LB培養(yǎng)基斜面活化，于35-38°C培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-36h。挑取新鮮培養(yǎng)的斜面一環(huán)，接種于含有40-60mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速150-200r/min，培養(yǎng)溫度35_38°C，培養(yǎng)時間12_16h，此為一級種子液。將培養(yǎng)成熟的一級種子液以1-10%的接種量接種于裝有800-1200mL種子培養(yǎng)基的5000mL三角瓶中，培養(yǎng)溫度35-38°C，轉(zhuǎn)速為120-180r/min，培養(yǎng)時間為8_12h，此為二級種子液。種子培養(yǎng)基:葡萄糖50-100g/L，酵母膏3-8g/L，玉米漿干粉5-lOg/L，氯化鈉l_5g/L，pH7.0-7.2
[0013]⑵5L發(fā)酵
[0014]5L發(fā)酵罐裝液量3.0-3.5L，米用一級種子液接種，接種量5_10%。發(fā)酵條件為:溫度35-38°C，攪拌轉(zhuǎn)速為300-350r/min，通氣量為1.5-2.0L/min，當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度降至0-10g/L時結(jié)束發(fā)酵。5L發(fā)酵進(jìn)程如附圖2所示。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖150-200g/L，酵母膏 5-10g/L，玉米漿干粉 5-10g/L，尿素 l_3g/L，pH6.0-6.5。
[0015](3)50L 發(fā)酵
[0016]50L發(fā)酵罐裝液量33-38L，米用二級種子液接種，接種量為5-10%。發(fā)酵條件為:溫度35-38°C，攪拌轉(zhuǎn)速為300-350r/min，通氣量為1.0-1.5m3/h。當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度降至0-10g/L時結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵進(jìn)程如附圖3所示。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖150-200g/L，酵母膏 5-10g/L，玉米楽干粉 5-10g/L，尿素 l_3g/L，pH6.0-6.5，
[0017](4)50L補(bǔ)料發(fā)酵
[0018]發(fā)酵罐裝液量30-35L，米用二級種子液接種，接種量5_10%。發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度35-38°C，攪拌轉(zhuǎn)速為300-350r/min，空氣流量為1.0-1.5m3/h。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖濃度低10g/L時，通過分次補(bǔ)加或流加的方式向發(fā)酵液中補(bǔ)加葡萄糖50-100g/L。分次補(bǔ)料發(fā)酵進(jìn)程如圖4所示。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖150-200g/L，酵母膏5-10g/L，玉米漿干粉5_10g/L，尿素l_3g/L，pH 6.0-6.5。流加葡萄糖溶液濃度70-75%，滅菌后使用。
[0019]本發(fā)明取得了以下技術(shù)效果:
[0020](I)拓展了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CCTCC No:M 2013181 的應(yīng)用范圍，發(fā)明人初期該菌株發(fā)現(xiàn)用于3-羥基丁酮的發(fā)酵生產(chǎn)，其產(chǎn)生極少量的2，3-丁二醇；由于不同的菌株，如不同的枯草芽孢桿菌，其生理生化性質(zhì)和代謝種類和能力往往差異較大，其積累的主要代謝產(chǎn)物也有所不同，如CN101008019A所公開的枯草芽孢桿菌CGMCCN0.1869以產(chǎn)3-羥基丁酮為主，不產(chǎn)生丁二酮、2，3-丁二醇等常見副產(chǎn)物，CN101851598A所公開的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 6_7以產(chǎn)2，3-丁二醇為主；而本發(fā)明所述的菌株通過改變培養(yǎng)條件，即可分別實(shí)現(xiàn)兩種不同產(chǎn)物的積累。
[0021](2)實(shí)現(xiàn)了采用安全性菌株Bacillus subtilis SFA-H43轉(zhuǎn)化葡萄糖高產(chǎn)2，3_ 丁二醇，產(chǎn)率達(dá) 110-120g/L。
【附圖說明】
[0022]圖1菌株SFA-H43的3_羥基丁酮發(fā)酵進(jìn)程
[0023]圖2菌株SFA-H43的2，3~ 丁二醇發(fā)酵進(jìn)程，5L發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0024]圖3菌株SFA-H43的2，3~ 丁二醇發(fā)酵進(jìn)程，50L發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0025]圖4菌株SFA-H43的2，3_ 丁二醇發(fā)酵進(jìn)程，50L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例
[0027]實(shí)施例一Bacillus subtilis SFA-H43 的 5L 發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0028](I)種子液的制備
[0029]從新鮮斜面接種一環(huán)至裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時間為12h，細(xì)胞密度(0D600)為0.68X10。種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，玉米楽干粉10g/L，氯化鈉2g/L，pH7.0。
[0030](2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0031]米用5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量為3.5L，將上述培養(yǎng)的種子液按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，通風(fēng)量為1.6L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min，定時取樣檢測發(fā)酵液的細(xì)胞密度((?600)、葡萄糖和2，3-丁二醇濃度。發(fā)酵周期72小時。最終檢測發(fā)酵液中的2，3- 丁二醇濃度為75.0g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成:葡萄糖160g/L，酵母膏10g/L，玉米漿干粉10g/L，尿素2g/L，滅菌前用10mol/L的氫氧化鈉將pH調(diào)至6.0，115°C滅菌20min。
[0032]實(shí)施例二Bacillus subtilis SFA-H43 的 5L 發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0033](I)種子液的制備
[0034]從新鮮斜面接種一環(huán)至裝有60mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，培養(yǎng)溫度36°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時間為16h，細(xì)胞密度(0D600)為0.73X10。種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖80g/L，酵母膏8g/L，玉米楽干粉5g/L，氯化鈉1.5g/L，pH7.0。
[0035](2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0036]米用5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量為3.5L，將上述培養(yǎng)的種子液按10 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)