粉紅單端孢菌及其發(fā)酵產(chǎn)物在防治小麥白粉病菌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種植物內(nèi)生真菌在生防領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別 設(shè)及植物內(nèi)生真菌曲/Wfeu曲TR-1或其發(fā)酵產(chǎn)物在防治小麥白粉病菌中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 粉紅單端抱菌（7>icAwAeci細(xì)？rase細(xì)？LinkRries)屬真菌口、半知菌類、叢 梗抱目、叢梗抱科、雙胞亞科、單端抱菌屬。r.rosw/??與人們的生產(chǎn)、生活關(guān)系密切，主要表 現(xiàn)在幾個(gè)方面：（1)該菌可引起多種作物病害，如木瓜果腐病、穗醋栗紅粉病、板栗實(shí)腐 病、香蕉和葡萄紅粉病、棉花紅粉病、蘋果霉屯、病、套袋鴨梨黑點(diǎn)病、番茄紅粉病及玉米粉紅 聚端抱穗腐病等；（2)該菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物一粉紅單端抱毒素，可導(dǎo)致食品毒素污染； 做r.rosww作為植物病害的生防因子也備受人們關(guān)注，目前已報(bào)道其發(fā)酵液在玉米小斑 病、小麥赤霉病、小麥紋枯病、煙草赤星病、西瓜枯萎病油菜菌核病和棉花黃萎病都具有一 定抑菌效果；因此，對(duì)r.rosw公fe防特征的深入了解，有助于人們對(duì)其致害性的科學(xué)防控 及其有益特性的充分利用。目前關(guān)于該菌對(duì)小麥白粉病菌的活性國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明人從草替中分離的一株內(nèi)生真菌化icAofAeci歴rose歴LinkexRries， 并發(fā)現(xiàn)其具有括抗小麥白粉病菌的生物活性。因此，本發(fā)明的目的在于提供內(nèi)生真菌 巧及其發(fā)酵產(chǎn)物在防治小麥白粉病菌中的應(yīng)用。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人從草替根莖部中分離到一株內(nèi)生真菌TR-1，并對(duì) 其進(jìn)行了分類鑒定，將菌株代號(hào)命名為TR-1，于2015年5月29日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物 保藏中屯、(地址：中國(guó)武漢塔挪山武漢大學(xué))，保藏號(hào)：CCTCCNO:M2015344,TR-1鑒定為 TrichotheciumroseumW_\。 陽(yáng)0化]另外，本發(fā)明人對(duì)所分離的內(nèi)生真菌TR-1做了進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)、同源性、培養(yǎng)方 法和生物活性等方面的特征進(jìn)行了研究，具體結(jié)果如下： 1、內(nèi)生真菌TR-1的形態(tài)特征 (1)菌落形態(tài)：TR-1在馬鈴馨-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextroseagar,PDA)上 25°C培養(yǎng)4d后在光學(xué)顯微鏡下觀察照片，在PDA培養(yǎng)基上菌絲的菌落中央為粉紅色且邊緣 呈白色絨毛狀。其菌落形態(tài)特征見圖1。
[0006] (2)抱子形態(tài)：分生抱子長(zhǎng)圓形或洋梨形，雙細(xì)胞，無色，抱基具偏乳頭突起，分生 抱子大小長(zhǎng)18. 0~19. 2ym(平均18. 5ym)，寬8. 4~9. 6ym(平均9. 0ym); 抱子多點(diǎn)出芽其有性形態(tài)特征見圖2。
[0007] 2、粉紅單端抱TR-1菌株濾液的制備 在250血的S角瓶中加入150血的PDB液體培養(yǎng)基，經(jīng)高壓滅菌后接入粉紅單端抱病 菌菌絲5塊(直徑約為5cm)，在25°C恒溫?fù)u床震蕩黑暗培養(yǎng)15d。用紗布過濾培養(yǎng)液，除去 菌絲及抱子，取過濾液過0. 22ym細(xì)菌濾膜，濾液即為粉紅單端抱備用濾液。
[000引 3、不同稀釋倍數(shù)的TR-1菌株濾液對(duì)小麥白粉菌的活性 采用離體葉段法，將培養(yǎng)至1葉1屯、的小麥，第1葉剪成30mm長(zhǎng)葉段，置于含50ug/ml苯拼咪挫的0. 5%的水瓊脂平板上，每皿(直徑60mm)擺放8片葉段。加入表面活性劑吐溫 20 (終濃度為2. 5X10 4)與發(fā)酵液充分混勻，在噴霧塔中施用，噴霧量4ml。設(shè)置6個(gè)處理， 分別為TR-1菌株濾液4ml，3ml，2ml，1ml，0. 5ml和0ml，剩余的用無菌水補(bǔ)足4ml。同時(shí)噴 施含2. 5X10 4吐溫20的PDB溶液處理為陰性對(duì)照，噴施清水為空白對(duì)照，自然驚干，24h 后接種小麥白粉病菌分生抱子(接種量為15個(gè)分生抱子/10倍視野)。然后放在17 ±rc的 空調(diào)房中培養(yǎng)，先避光12h，然后在24小時(shí)40W日光燈照射下(培養(yǎng)室）培養(yǎng)，結(jié)果見圖3。
[0009] 4、內(nèi)生真菌發(fā)酵液萃取物對(duì)小麥白粉菌活性測(cè)定 內(nèi)生真菌TR-1液體發(fā)酵培養(yǎng)7天，得總發(fā)酵液，經(jīng)離屯、或過濾得菌絲和菌液部分，用乙 酸萃取，濃縮成浸膏，得到乙酸提取物。準(zhǔn)確稱取TR-1菌株發(fā)酵液的乙酸提取物0.Olg，并 加入10mL無菌水，超聲波震蕩充分溶解，最終配置成濃度為1000mg/L的母液。采用離體 葉段法，將母液配置成10mg/L的工作液，用化ter噴霧塔均勻噴施到小麥離體葉段上，自 然驚干，24小時(shí)后接種新鮮的小麥白粉病菌，另設(shè)陰性對(duì)照組化酸處理)和空白對(duì)照組(純 水處理)，置于17°C培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。7天后調(diào)查發(fā)病情況，結(jié)果見圖4。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明從草替中分離到一株內(nèi)生真菌化icAWAeciu曲roseu曲 TR-1，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)小麥白粉菌具有較高的括抗活性，從而可將內(nèi)生真菌TR-1作為生防菌應(yīng) 用于小麥白粉菌引起的植物疾病的防治中。另外，由于內(nèi)生真菌TR-1發(fā)酵液的乙酸萃取物 具有更高的生防活性，因此可W繼續(xù)利用該植物內(nèi)生真菌資源獲得天然生物活性物質(zhì)，為 其開發(fā)和應(yīng)用W及探討內(nèi)生真菌的生理生態(tài)功能提供依據(jù)。
【附圖說明】 |；0〇11] 圖1為曲rase歴TR-1的菌落形態(tài)特征。 陽(yáng)〇1引 圖2為曲rose歴TR-1的抱子形態(tài)特征。
[001引 圖3為曲raseuM'R-l的發(fā)酵濾液對(duì)小麥白粉菌的活性測(cè)定結(jié)果，從 上向下依次為TR-1菌株濾液的4ml，3ml，2ml，1ml，0. 5ml和0ml處理。
[0014] 圖4為fAeciu曲的發(fā)酵液萃取物對(duì)小麥白粉菌活性測(cè)定結(jié)果。 從左到右依次為乙酸萃取相，乙酸乙醋萃取相，陰性CK。
【具體實(shí)施方式】
[0015] W下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明 的保護(hù)范圍并不限于運(yùn)些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0016] 實(shí)施例1:本發(fā)明所述粉紅單端抱TR-1的分離及鑒定 將采集新鮮植物的各部分組織在流水下沖洗，除去表面附著的泥沙，放入4°C冰箱保 存。內(nèi)生真菌的分離采用常規(guī)組織分離法，樣品先用無菌水清洗2次，將樣品切成1~2cm 長(zhǎng)小段放入75%酒精中浸泡1~2min(根據(jù)分離部位確定時(shí)間長(zhǎng)短)，用無菌水沖洗2~3 次.再用1. 5%有效氯含量的次氯酸鋼消毒7~lOmin，用無菌水沖洗3次，將表面消毒的 組織在滅菌的培養(yǎng)皿中用滅菌的刀片切成0. 2cmX0. 2cm的片段，用滅菌濾紙將消毒組織 塊表面的水分充分吸干。最后將組織塊移植到PDA培養(yǎng)基（含50U/mL硫酸鏈霉素和氨節(jié) 青霉素）平板上，置25°C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每隔1天進(jìn)行觀察，及時(shí)挑取切口處長(zhǎng)出 的新鮮菌絲，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板培養(yǎng)進(jìn)行編號(hào)保存。采用離體葉段法測(cè)定菌株其對(duì)小麥 白粉菌抑制作用，選擇活性的菌株，命名為菌株TR-1。結(jié)合常規(guī)的形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定將 其鑒定為粉紅單端抱。
[0017] 實(shí)施例2:本發(fā)明所述的TR-1菌株不同濾液對(duì)小麥白粉菌的活性 采用離體葉段法，將培養(yǎng)至1葉1屯、的小麥，第1葉剪成30mm長(zhǎng)葉段，置于含50ug/ml苯拼咪挫的0. 5%的水瓊脂平板上，每皿(直徑60mm)擺放8片葉段。加入表面活性劑吐溫 20 (終濃度為2. 5X10 4)與發(fā)酵液充分混勻，在噴霧塔中施用，噴霧量4ml。設(shè)置6個(gè)處理， 分別為TR-1菌株濾液4ml，3ml，2ml，1ml，0. 5ml和0ml，剩余的用無菌水補(bǔ)足4ml。同時(shí)噴 施含2. 5X10 4吐溫20的PDB溶液處理為陰性對(duì)照，噴施清水為空白對(duì)照，自然驚干，24h 后接種小麥白粉病菌分生抱子(接種量為15個(gè)分生抱子/1〇倍視野)。然后放在17 ±rc的 空調(diào)房中培養(yǎng)，先避光12h，然后在24小時(shí)40W日光燈照射下(培養(yǎng)室)培養(yǎng)。結(jié)果見表1。
[0018] 表1粉紅單端抱TR-1無菌濾液對(duì)小麥白粉菌的活性
實(shí)施例3:本發(fā)明所述的TR-1菌株發(fā)酵液萃取物對(duì)小麥白粉菌活性測(cè)定 發(fā)酵終止后過濾發(fā)酵產(chǎn)物，濾液于ll〇(K)r/min離屯、lOmin，取上清液，將有活性發(fā)酵液 進(jìn)行冷凍干燥，獲得干粉依次用乙酸和乙酸乙醋等體積萃取，萃取5次，每次lOmin。將有機(jī) 相收集，旋蒸濃縮成浸膏備用。水相回收。取LPS-1菌株發(fā)酵產(chǎn)物萃取物，將其配成lOmg/ L進(jìn)行活性測(cè)定。采用離體葉段法，噴霧量為350mL/m2,自然驚干，24小時(shí)后接種新鮮的小 麥白粉病菌，另設(shè)溶劑處理為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。置于17°C培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。7天后調(diào) 查發(fā)病情況。
[0019] TR-1菌株發(fā)酵液萃取物對(duì)小麥白粉菌活性
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種粉紅單端孢菌rase?TR-I及其發(fā)酵產(chǎn)物在防治小麥白粉菌中 的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉紅單端孢菌7>icAoMeci?rase?TR-I及其發(fā)酵產(chǎn) 物在防治小麥白粉菌中的應(yīng)用，其特征在于rase?TR-I于2015年5月 29日包藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物包藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNO:M2015344。
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明所述的內(nèi)生真菌是從草莓中分離獲得，經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定，命名粉紅單端孢<i>Trichothecium</i><i>？roseum</i>？TR-1,該菌株已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：中國(guó)？武漢？武漢大學(xué)），保藏號(hào)：CCTCC？NO:？M？2015344。本發(fā)明最顯著的特征是菌株液體發(fā)酵液及其乙醚萃取物都對(duì)小麥白粉菌有抑制作用，抑制效果達(dá)。該發(fā)明為<i>Trichothecium</i><i>？roseum</i>的進(jìn)一步研制和開發(fā)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株，是農(nóng)業(yè)上重要的微生物資源。CCTCC NO: M 201534420150529
【IPC分類】A01N63/04, A01P3/00
【公開號(hào)】CN105211105
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510682692
【發(fā)明人】喻大昭, 龔雙軍, 向禮波, 楊立軍
【申請(qǐng)人】湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所
【公開日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2015年10月20日