用于生產(chǎn)高度純化的多不飽和脂肪酸的色譜方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于生產(chǎn)高度純化的多不飽和脂肪酸及其衍生物的色譜方法。 技術(shù)背景
[0002] 運一部分提供了與本發(fā)明相關(guān)的背景信息，其不一定是現(xiàn)有技術(shù)。
[0003]脂肪酸（FA)，并更具體是多不飽和脂肪酸（PUFA)及其衍生物是重要的生物化合 物，其為細胞壁的組分并且參與多種生物過程，如激素（如前列腺素）合成，其在血小板聚 積、炎癥、甘油=醋水平降低、免疫應(yīng)答等中起到作用。
[0004] 正在開發(fā)并商業(yè)化日益增加的數(shù)量的基于PUFA的藥物。一些PUFA具有非常特異 性的功能。例如： 陽0化]-已知花生四締酸或ARA(C20 6O3)對于肌肉生長和修復(fù)而言是必須的
[0006] -二十二碳六締酸或DHA(C22 6CO3)已知特別在腦部發(fā)育和神經(jīng)傳導(dǎo)中起到重要 作用。
[0007]-二十碳五締酸或EPA(C20 5?3)已知降低甘油S醋。具體地，一些臨床研究已經(jīng) 顯示純EPA降低甘油S醋的水平，而不升高低密度脂蛋白（LDL也稱為"壞"）膽固醇水平。
[0008] -二十二碳五締酸或EPA(C22 5CO3)已知改善屯、血管健康。
[0009] 一些其它研究已經(jīng)顯示EPA和DHA的混合物在降低甘油S醋的同時增加LDL。
[0010] 因此，存在對生產(chǎn)包含EPA并含有不到0. 5 %DHA，優(yōu)選不帶0. 05%DHA，甚至更優(yōu) 選沒有可檢測水平的DHA的組合物需求。類似地，存在對生產(chǎn)包含DHA且基本不含ARA、或 包含ARA且基本不含DHA的組合物的潛在興趣，并且一般而言存在對生產(chǎn)高度純化的PUFA 的潛在興趣，其組合物基本排除其它PUFA(或其它FA)W能夠基于具有更容易控制的功效 和更少副作用的高度純化的單一PUFA開發(fā)并商業(yè)化新藥。
[0011] 例如，一般從魚油、藻類或酵母中純化EPA。然而，魚油和其它生物物質(zhì)也含有大量 的脂肪酸，尤其是大量的DHA，其需要從EPA中分離。
[0012] 可從魚油純化DHA，魚油中需要分離大量的其它脂肪酸包括EPA，在衍生自魚類的 大多數(shù)油中其豐度甚至高于DHA。替代地，例如，可從藻類生產(chǎn)DHA，由于藻類中存在相當(dāng)量 的ARA，并且因此需要從ARA中分離DHA。相反，當(dāng)從藻類來源純化ARA時，必須從DHA中分 離ARA。
[0013] 生產(chǎn)純化的PUFA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。它們一般包括W下步驟中的 一個或多個：水解步驟W將甘油=醋轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸，或者甘油=醋醋交換步驟W將脂 肪酸轉(zhuǎn)化為烷基醋（優(yōu)選乙醋），漂白步驟，尿素分饋步驟，分子蒸饋步驟，色譜步驟等。雖 然分子蒸饋是一種廣泛使用的富集長鏈PUFA技術(shù)，其不能用于高效彼此分離長鏈PUFA。此 外，PUFA是非常脆的分子，其易于氧化和降解。當(dāng)加熱時，PUFA易于異構(gòu)化、氧化、過氧化和 寡聚化。
[0014] 色譜過程是富集PUFA的高效手段并可與上述純化技術(shù)中的一種或多種組合。最 廣泛描述的色譜過程是單根柱色譜過程，包括例如高效液相色譜OffLC)過程或穩(wěn)態(tài)回收 色譜過程，和多柱色譜技術(shù)，如模擬移動床（SMB)、VARICOL?或?qū)嶋H移動床（AMB)過程W及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它過程。由于PUFA-般W非常復(fù)雜的混合物生產(chǎn)，一般需要 2或3個色譜步驟來達到高純度。運些過程中的一些描述于W下文件：US5,719,302、US 2011/0091947、WO2011/080503、WO2013/005048、WO2013/005051、WO2013/005052,其各 自通過引用全文納入本文。
[0015] 在能夠同時進行2個色譜步驟的一些SMB或AMB過程中，一個或多個具體含有中 間純度的目標PUFA的流可經(jīng)再注射到SMB或AMB設(shè)備的非相鄰柱而不需要濃縮。
[0016] 大多數(shù)色譜過程包括使用反相模式，使用水性有機溶劑。按照極性分離脂肪酸 (一般為醋形式），其中極性更強的脂肪酸比極性更弱的脂肪酸更早洗脫，如本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知。
[0017] 色譜過程的主要缺陷之一是它們導(dǎo)致純化部分的大量稀釋。連續(xù)過程如SMB、 VARIC0L?和AMB可能優(yōu)于分批過程如HPLC，因為它們一般產(chǎn)生濃度更高的流，其稱為提取 物（含有更需要保留的化合物）和萃余液（含有不太需要保留的化合物）。
[0018] 但是，由色譜分離產(chǎn)生的純化和廢棄部分仍然是非常稀的，因而出于經(jīng)濟和環(huán)境 上的原因，需要濃縮各收集的流W回收所用的洗脫劑（主要由一種或多種有機溶劑和水組 成）并使它們在過程中再循環(huán)。
[0019] 一般而言仍然存在對用有限的溶劑消耗將PUFA純化至較高純度的改進方法的需 求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 運一部分提供了本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
，而不是其全部范圍或其所有特征的全面公 開。具體公開了用于從進料混合物中回收多不飽和脂肪酸的各種實施方式。方法可任選地 包括超過一種本文所述的W下方法、步驟或特征的任意一種或任意組合。
[0021] 本發(fā)明具體設(shè)及W下項。
[0022] 第1項一種從進料混合物中回收第一多不飽和脂肪酸的方法，其中除了所述第一 多不飽和脂肪酸W外，所述進料混合物包含至少一種第二脂肪酸，所述方法包括：
[0023]-使用水性有機洗脫劑進行色譜分離的主要步驟并從而收集富集第一多不飽和脂 肪酸的第一洗脫劑流和富集第二脂肪酸的第二洗脫劑流；
[0024]-使第二洗脫劑流經(jīng)過濃縮步驟W-方面得到濃縮脂肪酸流和另一方面得到耗盡 的第二洗脫劑流，其中耗盡的第二洗脫劑流的水與有機物之比低于第二洗脫劑流的水與有 機物之比；
[00巧]-再循環(huán)至少部分的耗盡的第二洗脫劑流用于色譜分離的主要步驟中。
[00%] 第2項第1項的方法，其中全部的耗盡的第二洗脫劑流再循環(huán)并用于色譜分離的 主要步驟中。
[0027]第3項第1或第2項的方法，其中耗盡的第二洗脫劑流的流速相對于第二洗脫劑 流的流速降低，優(yōu)選相對于第二洗脫劑流的流速降低至少約2%，或至少約5%，或至少約 10%，或至少約15%。
[00測第4項第1-3項中任一項的方法，其中，耗盡的第二洗脫劑流的水與有機物之比低 于（或等于）第二洗脫劑流的水與有機物之比的約0. 95倍，優(yōu)選低于（或等于）第二洗脫 劑流的水與有機物之比的約0. 9倍、或低于（或等于）約0. 8倍、或低于（或等于）約0. 7 倍、或低于（或等于）約0. 6倍、或低于（或等于）約0. 5倍、或低于（或等于）約0. 4倍、 或低于（或等于）約0. 3倍、或低于（或等于）約0. 2倍、或低于（或等于）約0. 1倍。
[0029] 第5項第1-4項中任一項的方法，該方法包括：
[0030]-使第一洗脫劑流經(jīng)濃縮步驟W-方面得到濃縮脂肪酸流和另一方面得到耗盡的 第一洗脫劑流，并且
[0031]-再循環(huán)至少部分、優(yōu)選全部的耗盡的第一洗脫劑流，優(yōu)選用于色譜分離的主要步 驟中。
[0032] 第6項第5項的方法，其中耗盡的第一洗脫劑流的流速是第一洗脫劑流的流速的 至少90 %，優(yōu)選至少95 %，最優(yōu)選至少98 %。
[0033] 第7項第1-6項中任一項的方法，其包括單個分離步驟，即色譜分離的主要步驟。
[0034] 第8項第1-6項中任一項的方法，其包括在色譜分離的主要步驟之前的單個預(yù)先 的分離步驟，所述單個預(yù)先的分離步驟優(yōu)選是預(yù)先的色譜分離步驟，其中所述單個預(yù)先的 色譜分離步驟和色譜分離的主要步驟在相同的色譜單元或不同的色譜單元中進行。
[0035] 第9項第1-6項中任一項的方法，其在色譜分離的主要步驟之前包括2個預(yù)先的 分離步驟，其中優(yōu)選2個預(yù)先的分離步驟中的一個是預(yù)先的色譜分離步驟，并且更優(yōu)選2個 預(yù)先的分離步驟是預(yù)先的色譜分離步驟，各預(yù)先的色譜分離步驟和色譜分離的主要步驟在 相同的色譜單元或不同的色譜單元中進行，并且運2個預(yù)先的色譜分離步驟在相同色譜單 元或不同色譜單元中進行。
[0036] 第10項第8或9項的方法，其中部分的耗盡的第二洗脫劑流再循環(huán)用于預(yù)先的分 離步驟。
[0037] 第11項第1-6或8-9項中任一項的方法，其包括在色譜分離的主要步驟之后的單 個額外分離步驟，所述單個額外分離步驟優(yōu)選是額外的色譜分離步驟，其中所述額外的色 譜分離步驟和色譜分離的主要步驟在相同的色譜單元或不同的色譜單元中進行。
[0038] 第12項第1-6或8-9項中任一項的方法，其在色譜分離的主要步驟之后包括2個 額外分離步驟，其中優(yōu)選2個額外分離步驟中的一個是額外的色譜分離步驟，并且更優(yōu)選2 個額外的分離步驟是額外的色譜分離步驟，各額外的色譜分離步驟和色譜分離的主要步驟 在相同的色譜單元或不同的色譜單元中進行，并且運2個額外的色譜分離步驟在相同色譜 單元或不同色譜單元中進行。
[0039] 第13項第1-6項中任一項的方法，該方法基本上由3個或更多個色譜分離步驟， 優(yōu)選3個色譜分離步驟組成（或由其組成），所述色譜分離步驟在不同的色譜單元或至少部 分在相同色譜單元中進行。
[0040] 第14項第13項的方法，該方法基本上由色譜分離的主要步驟、色譜分離的主要步 驟之前進行的預(yù)先的色譜分離步驟、W及色譜分離的主要步驟之后進行的額外的色譜分離 步驟組成（或由其組成）。
[0041] 第15項第13項的方法，該方法基本上由2個預(yù)先的色譜分離步驟和之后的色譜 分離的主要步驟組成（或由其組成）。
[0042] 第16項第13項的方法，該方法基本上由色譜分離的主要步驟和之后的2個額外 的色譜分離步驟組成（或由其組成）。
[0043] 第17項第1-16項中任一項的方法，其中進料混合物還包含至少第=脂肪酸，并且 該方法包括：
[0044]-使用水性有機洗脫劑進行色譜分離的二級步驟并從而收集富集第一多不飽和脂 肪酸的第=洗脫劑流和富集第=脂肪酸的第四洗脫劑流；
[0045]-使第=洗脫劑流經(jīng)濃縮步驟W-方面得到濃縮脂肪酸流和另一方面得到耗盡的 第=洗脫劑流，并且然后
[0046]-再循環(huán)至少部分、優(yōu)選全部的耗盡的第=洗脫劑流，優(yōu)選用于色譜分離的二級步 驟中訊/或
[0047]-使第四洗脫劑流經(jīng)過濃縮步驟W-方面得到的濃縮脂肪酸流和另一方面得到耗 盡的第四洗脫劑流，其中耗盡的第四洗脫劑流的水與有機物之比任選地低于第四洗脫劑流 的水與有機物之比；并且然后
[0048]-再循環(huán)至少部分、優(yōu)選全部的耗盡的第四洗脫劑流，優(yōu)選用于色譜分離的二級步 驟中。
[0049] 第18項第17項的方法，其中色譜分離的二級步驟是在色譜分離的主要步驟之前 進行的預(yù)先的色譜分離步驟；或者其中色譜分離的二級步驟是在色譜分離的主要步驟之后 進行的額外的色譜分離步驟。
[0050] 第19項第17或18項的方法，其中在色譜分離的主要步驟和色譜分離的二級步驟 中使用相同的水性有機洗脫劑；或者其中在色譜分離的主要步驟和色譜分離的二級步驟中 使用不同的水性有機洗脫劑；并且優(yōu)選在色譜分離的主要步驟中使用的水性有機洗脫劑的 水與有機物之比與則色譜分離的二級步驟中使用的水性有機洗脫劑的水與有機物之比不 同。
[0051] 第20項第17-19項中任一項的方法，其中進料混合物還包含至少第四脂肪酸，并 且該方法包括：
[0052]-使用水性有機洗脫劑進行色譜分離的=級步驟并從而收集富集第一多不飽和脂 肪酸的第五洗脫劑流和富集第四脂肪酸的第六洗脫劑流；
[0053]-使第五洗脫劑流經(jīng)濃縮步驟W-方面得到濃縮脂肪酸流和另一方面得到耗盡的 第五洗脫劑流，并且然后
[0054]-再循環(huán)至少部分、優(yōu)選全部的耗盡的第五洗脫劑流，優(yōu)選用于色譜分離的=級步 驟中訊/或
[0055]-使第六洗脫劑流經(jīng)過濃縮步驟W-方面得到的濃縮脂肪酸流和另一方面得到耗 盡的第六洗脫劑流，其中耗盡的第六洗脫劑流的水與有機物之比任選地低于第四洗脫劑流 的水與有機物之比；并且然后
[0056]-再循環(huán)至少部分、優(yōu)選全部的耗盡的第六洗脫劑流，優(yōu)選用于色譜分離的二級步 驟中。
[0057] 第21項第20項的方法，其中色譜分離的=級步驟是在色譜分離的主要步驟之前 進行的預(yù)先的色譜分離步驟；或者其中色譜分離的=級步驟是在色譜分離的主要步驟之后 進行的額外的色譜分離步驟。 陽05引第22項第20或21項的方法，其中：
[0059]-在色譜分離的主要步驟和色譜分離的=級步驟中使用相同的水性有機洗脫劑； 或者其中在色譜分離的主要步驟和色譜分離的=級步驟中使用不同的水性有機洗脫劑；并 且優(yōu)選在色譜分離的主要步驟中使用的水性有機洗脫劑的水與有機物之比與則色譜分離 的=級步驟中使用的水性有機洗脫劑的水與有機物之比不同；和/或
[0060]-在色譜分離的二級步驟和色譜分離的=級步驟中使用相同的水性有機洗脫劑； 或者其中在色譜分離的二級步驟和色譜分離的=級步驟中使用不同的水性有機洗脫劑；并 且優(yōu)選在色譜分離的二級步驟中使用的水性有機洗脫劑的水與有機物之比與則色譜分離 的=級步驟中使用的水性有機洗脫劑的水與有機物之比不同。
[0061] 第23項第20-22項中任一項的方法，其中第一多不飽和脂肪酸是二十碳五締酸， 第二脂肪酸是二十二碳六締酸或十八碳四締酸，并且第=和第四醋飯館選自其它的二十二 碳六締酸或十八碳四締酸、飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸。
[0062] 第23a項第1-23項中任一項的方法，其包括在色譜分離的主要步驟中再循環(huán)和使 用之前向耗盡的第二洗脫劑流中添加新鮮的水。
[0063] 第24項一種從進料混合物中回收第一多不飽和脂肪酸的方法，其中除了所述第 一多不飽和脂肪酸W外，所述進料混合物包含至少至少一種第二脂肪酸，所述方法包括：
[0064]-使用水性有機洗脫劑進行色譜分離的主要步驟并從而收集富集第一多不飽和脂 肪酸的第一洗脫劑流和富集第二脂肪酸的第二洗脫劑流； 陽〇化]-使第二洗脫劑流經(jīng)濃縮步驟W-方面得到濃縮脂肪酸流和另一方面得到耗盡的 第二洗脫劑流；
[0066]-再循環(huán)至少部分的耗盡的第二洗脫劑流用于除了色譜分離的主要步驟W外的其 它處理步驟中。
[0067] 所述其它處理步驟可W是回收第一多不飽和脂肪酸的步驟。替代地，其可W是另 一個目的的步驟，如純化或生產(chǎn)另一種化合物。
[0068] 按照第24項的優(yōu)選實施方式，用于另一個處理步驟的至少部分的耗盡的第二洗 脫劑流W液體形式使用。優(yōu)選不W從濃縮步驟中得到的蒸氣相的形式直接使用。雖然從耗 盡的第二洗脫劑流回收熱量可能是第24項中提及的使用的部分，所述用途并不限于熱量 回收。所述使用優(yōu)選包括混合至少部分的耗盡的第二洗脫劑流與另一種流或產(chǎn)物或者對至 少部分的耗盡的第二洗脫劑流進行化學(xué)修飾（如使其經(jīng)過燃燒）。
[0069] 第25項第24項的方法，其中耗盡的第二洗脫劑流沒有經(jīng)再循環(huán)并用于色譜分離 的主要步驟中。 陽070] 第26項第24或25項的方法，其中至少部分、優(yōu)選全部的耗盡的第二洗脫劑流經(jīng) 再循環(huán)W用作分離一種物質(zhì)與另一種物質(zhì)的步驟中的洗脫劑，優(yōu)選色譜分離一種物質(zhì)與離 那個一種物質(zhì)，和/或用作染料，和/或用于再生溶劑。
[0071] 第27項第24-26項中任一項的方法，該方法包括：
[0072]-在色譜分離的主要步驟之前，使用相應(yīng)的水性有機洗脫劑進行一個或多個預(yù)先 的分離步驟；
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