本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品深加工及其副產(chǎn)品綜合利用的技術(shù)領(lǐng)域，涉及以脫脂小麥胚芽為原料制備免疫球蛋白和免疫活性肽的方法。

背景技術(shù)：

小麥胚芽是小麥生長發(fā)育的重要器官，是小麥的生命源泉，被譽(yù)為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”。由于小麥胚芽中富含不飽和脂肪酸，色素和酶，會影響面粉的色澤及貯藏期，因此在制粉過程中往往將小麥胚芽剔除。我國每年可開發(fā)利用的小麥胚芽量高達(dá)幾百萬噸,但絕大多數(shù)都未被合理利用。目前對于小麥胚芽油的利用率較高，而剩余的脫脂小麥胚芽粕往往作為飼料或者直接丟棄，造成極大的浪費(fèi)。因此如何利用脫脂小麥胚芽粕，以創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益具有十分重要的意義。

脫脂小麥胚芽中蛋白含量約為30%，其中球蛋白占的比例約為15.6%。球蛋白的氨基酸含量均衡，必需氨基酸占總氨基酸的比例在麥胚各蛋白中最高，其中蘇氨酸、纈氨酸、組氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸含量較高。除蛋氨酸外，其它必需氨基酸與fao/who推薦模式相符。其次球蛋白的蛋白消化率在麥胚各蛋白中最高，是非常有價值的天然蛋白質(zhì)。經(jīng)過免疫活性評價發(fā)現(xiàn)，球蛋白具有一定的免疫效果。目前對于免疫蛋白主要是乳源及大豆源，小麥胚芽蛋白未見報道。多肽是蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，多肽與蛋白質(zhì)相比，更容易被機(jī)體所利用。目前已報道的免疫活性肽已有很多，但是主要是動物源活性肽。眾所周知，植物源活性肽相對動物源，更加安全、健康，來源廣泛，因此植物源的免疫活性肽越來越受到關(guān)注。植物源中大豆免疫活性肽報道的較多，而小麥胚芽源免疫活性肽尚未被報道。因此以小麥胚芽為原料，開發(fā)免疫活性蛋白和多肽對增加小麥的附加值也具有深遠(yuǎn)意義。

蛋白及多肽的免疫活性評價方法包括非特異性免疫和特異性免疫，其中非特異性免疫指細(xì)胞的固有免疫，而特異性免疫又分為細(xì)胞免疫和體液免疫。本發(fā)明建立的免疫評價體系涵蓋了非特異性和特異性免疫，其中巨噬細(xì)胞吞噬中性紅屬于細(xì)胞的非特異性免疫，刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化屬于細(xì)胞免疫，而刺激巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如一氧化氮、白介素、腫瘤壞死因子等具有殺傷侵入的外來物的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供以脫脂小麥胚芽為原料制備免疫球蛋白和免疫活性肽的方法，，使用本發(fā)明的方法可以獲得蛋白含量為85.3%，分子量主要分布在37kda和55kda，必需氨基酸與總氨基酸的比值（e/t）為42.49%，蛋白質(zhì)消化率校正后的氨基酸分?jǐn)?shù)（pdcaas）為0.42的免疫球蛋白以及水解度為9.1%-20.1%，分子量低于1450da，蛋白含量為72.2%-84.6%，可溶性肽得率為40.3%-69.3%的免疫活性肽。

本發(fā)明技術(shù)方案如下。

以脫脂小麥胚芽為原料制備免疫球蛋白和免疫活性肽的方法，取脫脂小麥胚芽為原料，經(jīng)過鹽提酸沉，透析及冷凍干燥得到免疫球蛋白；用蛋白酶對球蛋白進(jìn)行水解、大孔樹脂吸附與解離，濃縮及冷凍干燥，獲得水解度為9.1%-20.1%，分子量低于1450da，蛋白含量為72.2%-84.6%，可溶性肽得率為40.3%-69.3%的球蛋白免疫活性肽。

上述方法，包括如下步驟：

（1）小麥胚芽球蛋白的制備：將過100-300目的脫脂小麥胚芽粉以1：10-1:30w/v的比例加入水，在20-40℃下攪拌1-3h，6000-9000r/min低溫離心10-20min后，將沉淀繼續(xù)以1：10-1:30w/v的比例添加50-100mmtris-hcl（ph8.0）所述tris-hcl中含0.3-0.5mnacl的溶液，同樣在20-40℃下攪拌1-3h，6000-9000r/min低溫離心10-20min；獲得的上清液用0.1-1m的hcl調(diào)ph至4.0，6000-9000r/min低溫離心10-15min后，復(fù)溶并調(diào)ph至7.0，然后透析并冷凍干燥，得到麥胚球蛋白；

（2）酶解：將上述所得麥胚球蛋白配成4%-5%的蛋白溶液，在90-95℃保溫5-10min，再冷卻至37-55℃，用0.1-1mnaoh調(diào)節(jié)ph,使ph值在7.5-8.0，加入胰蛋白酶、堿性蛋白酶或中性蛋白酶，在37-55℃水浴下水解3h，反應(yīng)過程中不斷加入1m的naoh，使ph保持不變，水解完成后，調(diào)節(jié)ph至7.0，95-100℃滅酶5-10min，冷卻后，6000-9000r/min離心5-10min，保留上清液并冷凍干燥，得到多肽；

（3）大孔樹脂吸附與解離：將上述得到的多肽配成濃度為10-30g/l的溶液，吸附到大孔樹脂后，用水洗脫至流出液的吸光值與水接近，再用75%的乙醇洗脫，收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥，得到免疫活性肽。

上述方法中，所述脫脂小麥胚芽粉的蛋白含量25-30%，水分含量為5-10%，灰分含量為5-10%。

上述方法中，所述水包括蒸餾水、純凈水、去離子水中的任意一種。

上述方法中，所述透析中使用的水包括蒸餾水、純凈水、去離子水、自來水中的任意一種，但是都要保持低溫，當(dāng)使用自來水時用流水透析。

上述方法中，堿性蛋白酶為液體或固體的任意一種；所述堿性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶的添加量滿足：每1kg底物加入10⁷u的酶，以堿性蛋白酶為例，如果它的酶活力是200u，那么1kg球蛋白需要加入50g堿性蛋白酶。

上述方法中，所述大孔樹脂選自da201-c型號。

上述方法中，所述麥胚球蛋白的蛋白含量為85.3%，分子量主要分布在37kda和55kda，必需氨基酸與總氨基酸的比值（e/t）為42.49%，蛋白質(zhì)消化率校正后的氨基酸分?jǐn)?shù)（pdcaas）為0.42。

上述方法中，所述免疫活性肽的水解度為9.1%-20.1%，分子量低于1450da，蛋白含量為72.2%-84.6%，可溶性肽得率為40.3%-69.3%。

上述方法中，經(jīng)過免疫活性評價證明，在藥物劑量為80μg/ml時，與空白對照組相比，球蛋白對小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力提高了5.8%，raw264.7細(xì)胞的吞噬能力提高了15.11%，raw264.7細(xì)胞分泌no，il-6，il-12和tnf-α的能力分別提高了23.5%，40.3%，93.1%和253.4%。經(jīng)過水解球蛋白，在藥物劑量為80μg/ml時，與空白對照組相比，球蛋白多肽對小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力提高了2.8%-27%，raw264.7細(xì)胞的吞噬能力提高了73.1%-114.6%，raw264.7細(xì)胞分泌no，il-6，il-12和tnf-α的能力分別提高了53.0%-81.35%，61.1%-326.3%，187.3%-305.1%和310.8%-703.1%。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

（1）本發(fā)明采用的原料是小麥胚芽榨油后的副產(chǎn)物，來源廣泛，營養(yǎng)豐富,蛋白含量高。

（2）本發(fā)明可以得到兩種產(chǎn)品，一個是氨基酸組成全面、且具有免疫功效的球蛋白，一個是具有更高免疫功效且易被機(jī)體吸收利用的多肽。

（3）本發(fā)明是以小麥胚芽油的副產(chǎn)物脫脂小麥胚芽粕為原料，提取球蛋白，然后用不同蛋白酶分別水解球蛋白，在一套工藝下可同時制備具有免疫活性的球蛋白和球蛋白多肽。工藝簡單、高效，并且資源利用率高。

（4）本發(fā)明采用的免疫活性評價體系涵蓋了特異性和非特異性免疫，可以較為全面的評價蛋白及多肽的免疫活性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的制備免疫球蛋白和免疫活性肽的工藝方法流程圖；

圖2為麥胚球蛋白及其酶解產(chǎn)物對小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)的影響圖；

圖3為麥胚球蛋白及其酶解產(chǎn)物對raw264.7細(xì)胞吞噬能力的影響圖；

圖4為麥胚球蛋白及其酶解產(chǎn)物對raw264.7細(xì)胞產(chǎn)no能力的影響圖；

圖5為麥胚球蛋白及其酶解產(chǎn)物對raw264.7細(xì)胞產(chǎn)il-6能力的影響圖；

圖6為麥胚球蛋白及其酶解產(chǎn)物對raw264.7細(xì)胞產(chǎn)il-12能力的影響圖；

圖7為麥胚球蛋白及其酶解產(chǎn)物對raw264.7細(xì)胞產(chǎn)tnf-α能力的影響圖；

圖中：blank指空白對照組，cona和lps分別是陽性對照組，globulin是球蛋白，th、nh和ah分別是胰蛋白酶酶解物、中性蛋白酶酶解物和堿性蛋白酶酶解物。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。

本發(fā)明工藝方法流程圖見圖1。

實(shí)施例1

以蛋白含量為27%，脂肪含量為0.75%，水分含量為7.4%，灰分含量為6.9%的脫脂小麥胚芽為原料,將過200目的脫脂小麥胚芽粉以1：10（kg/l）的比例加入水，在25℃下攪拌2h，8000r/min低溫離心10-20min后，將沉淀繼續(xù)以1：10的比例添加50mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同樣在25℃下攪拌2h，8000r/min低溫離心10-20min。獲得的上清液用1m的hcl調(diào)ph至4.0，9000r/min低溫離心10-15min后，復(fù)溶并調(diào)ph至7.0，然后用蒸餾水透析72h并冷凍干燥，得到麥胚球蛋白。其蛋白含量為85.3%，分子量主要分布在37kda和55kda，必需氨基酸與總氨基酸的比值（e/t）為42.49%，蛋白質(zhì)消化率校正后的氨基酸分?jǐn)?shù)（pdcaas）為0.42。在藥物劑量為80μg/ml時，球蛋白對小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值si為1.06，比空白對照提高了5.8%，raw264.7細(xì)胞的吞噬率為124.83%，比空白對照提高了15.11%，raw264.7細(xì)胞產(chǎn)no，il-6，il-12和tnf-α的量分別是24.13μm、309.92pg/ml、349.40pg/ml和5.15ng/ml，比空白對照分別提高了23.5%，40.3%，93.1%和253.4%（如圖2~圖7所示）。

實(shí)施例2

以蛋白含量為27%，脂肪含量為0.75%，水分含量為7.4%，灰分含量為6.9%的脫脂小麥胚芽為原料,將過200目的脫脂小麥胚芽粉以1：10（kg/l）的比例加入水，在25℃下攪拌2h，8000r/min低溫離心10-20min后，將沉淀繼續(xù)以1：10的比例添加50mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同樣在25℃下攪拌2h，8000r/min低溫離心10-20min。獲得的上清液用1m的hcl調(diào)ph至4.0，9000r/min低溫離心10-15min后，復(fù)溶并調(diào)ph至7.0，然后用蒸餾水透析72h透析并冷凍干燥，得到麥胚球蛋白。球蛋白配成4%的蛋白溶液，在90-95℃保溫10min，再冷卻至37℃。用1mnaoh調(diào)節(jié)ph至8.0，加入胰蛋白酶，加酶量是每1kg球蛋白加40g胰蛋白酶（酶活250u/mg）。在37℃水浴下水解3h，反應(yīng)過程中不斷加入1m的naoh,使ph保持不變。水解完成后，調(diào)節(jié)ph至7.0，95-100℃滅酶5-10min，冷卻后，9000r/min離心5min，保留上清液并冷凍干燥。將上述得到的多肽配成濃度為10-30g/l的溶液，吸附到大孔樹脂（da201-c）后，用水洗脫至流出液的吸光值與水接近，再用75%的乙醇洗脫，收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥。得到的酶解產(chǎn)物水解度為9.1%，分子量低于1450da，蛋白含量為84.6%，可溶性肽得率為40.3%。在藥物劑量為80μg/ml時，胰蛋白酶解多肽對對小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值si為1.03，比空白對照提高了2.8%；raw264.7細(xì)胞的吞噬率為176.03%，比空白對照提高了76.0%；raw264.7細(xì)胞分泌no，il-6，il-12和tnf-α的量分別是29.88μm、478.12pg/ml、519.77pg/ml和5.99ng/ml，比空白對照分別提高了53.0%，116.4%，187.3%和310.8%（如圖2~圖7所示）。

實(shí)施例3

以蛋白含量為27%，脂肪含量為0.75%，水分含量為7.4%，灰分含量為6.9%的脫脂小麥胚芽為原料,將過200目的脫脂小麥胚芽粉以1：10（kg/l）的比例加入水，在25℃下攪拌2h，8000r/min低溫離心10-20min后，將沉淀繼續(xù)以1：10的比例添加50mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同樣在25℃下攪拌2h，8000r/min低溫離心10-20min。獲得的上清液用1m的hcl調(diào)ph至4.0，9000r/min低溫離心10-15min后，復(fù)溶并調(diào)ph至7.0，然后用蒸餾水透析72h透析并冷凍干燥，得到麥胚球蛋白。球蛋白配成4%的蛋白溶液，在90-95℃保溫10min，再冷卻至55℃。用1mnaoh調(diào)節(jié)ph至7.5，加入中性蛋白酶，加酶量是每1kg球蛋白加166.7g胰蛋白酶（酶活60u/mg）。在55℃水浴下水解3h，反應(yīng)過程中不斷加入1m的naoh,使ph保持不變。水解完成后，調(diào)節(jié)ph至7.0，95-100℃滅酶5-10min，冷卻后，9000r/min離心5min，保留上清液并冷凍干燥。將上述得到的多肽配成濃度為10-30g/l的溶液，吸附到大孔樹脂后，用水洗脫至流出液的吸光值與水接近，再用75%的乙醇洗脫，收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥。得到的酶解產(chǎn)物水解度為20.1%，分子量低于1450da，蛋白含量為72.2%，可溶性肽得率為69.3%。在藥物劑量為80μg/ml時，中性蛋白酶解多肽對小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值si為1.05，比空白對照提高了5.3%，raw264.7細(xì)胞的吞噬率為173.06%，比空白對照提高了73.1%，raw264.7細(xì)胞分泌no，il-6，il-12和tnf-α的量分別為35.40μm、355.92pg/ml、537.04pg/ml和7.42ng/ml，比空白對照分別提高了81.3%，61.1%，196.9%和408.9%（如圖2~圖7所示）。

實(shí)施例4

以蛋白含量為27%，脂肪含量為0.75%，水分含量為7.4%，灰分含量為6.9%的脫脂小麥胚芽為原料,將過200目的脫脂小麥胚芽粉以1：10（kg/l）的比例加入水，在25℃下攪拌2h，8000r/min低溫離心10-20min后，將沉淀繼續(xù)以1：10的比例添加50mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同樣在25℃下攪拌2h，8000r/min低溫離心10-20min。獲得的上清液用1m的hcl調(diào)ph至4.0，9000r/min低溫離心10-15min后，復(fù)溶并調(diào)ph至7.0，然后用蒸餾水透析72h透析并冷凍干燥，得到麥胚球蛋白。球蛋白配成4%的蛋白溶液，在90-95℃保溫10min，再冷卻至50℃。用1mnaoh調(diào)節(jié)ph至8.0，加入中性蛋白酶，加酶量是每1kg球蛋白加50g堿性蛋白酶（酶活200u/mg）。在50℃水浴下水解3h，反應(yīng)過程中不斷加入1m的naoh,使ph保持不變。水解完成后，調(diào)節(jié)ph至7.0，95-100℃滅酶5-10min，冷卻后，9000r/min離心5min，保留上清液并冷凍干燥。將上述得到的多肽配成濃度為10-30g/l的溶液，吸附到大孔樹脂后，用水洗脫至洗脫液的吸光值與水接近，再用75%的乙醇洗脫，收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥。得到的酶解產(chǎn)物水解度為19.1%，分子量低于1450da，蛋白含量為76.2%，可溶性肽得率為55.7%。在藥物劑量為80μg/ml時，堿性蛋白酶解多肽對小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值si為1.27，比空白對照提高了27.4%，raw264.7細(xì)胞的吞噬率為214.59%，比空白對照提高了114.6%，raw264.7細(xì)胞分泌no，il-6，il-12和tnf-α的量為33.22μm、941.72pg/ml、732.83pg/ml和11.71ng/ml，比空白對照分別提高了70.1%，326.3%，305.1%和703.2%（如圖2~圖7所示）。

本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。