微囊泡及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微囊泡及其制造方法。
[0002] 背景領(lǐng)域
[0003] 已知多種細(xì)胞在體內(nèi)分泌或釋放微囊泡（小型膜囊泡），例如，外來體。人們已經(jīng) 認(rèn)為微囊泡的作用之一是在細(xì)胞外釋放不必要的細(xì)胞內(nèi)組分。然而近年來，示出了微囊泡 作為信號(hào)傳遞載體在分泌細(xì)胞和其靶細(xì)胞之間傳遞諸如蛋白質(zhì)或脂類的物質(zhì)并且在細(xì)胞 間相互作用中起作用的可能性。
[0004] 至今已經(jīng)提出了微囊泡尤其是外來體的多種臨床應(yīng)用。例如，專利文獻(xiàn)1公開了 從包含瘧原蟲屬（Plasmodium sp.)抗原的網(wǎng)狀細(xì)胞中分離的外來體在防御瘧疾中的用途。 專利文獻(xiàn)2公開了使用來自B細(xì)胞的外來體治療癌癥。專利文獻(xiàn)3公開了干細(xì)胞衍生的微 囊泡在內(nèi)皮再生或上皮再生中的用途。
[0005] 慢病毒，例如，人類免疫缺陷病毒（HIV)感染細(xì)胞并且具有被整合到分裂細(xì)胞和 非分裂細(xì)胞兩者的基因組內(nèi)的性質(zhì)。因此，基于慢病毒基因組序列的慢病毒載體作為基因 轉(zhuǎn)導(dǎo)工具被廣泛應(yīng)用。
[0006] 引用列表
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)1 :國(guó)際公布TO2011/080271
[0009] 專利文獻(xiàn)2 :國(guó)際公布W02011/000551
[0010] 專利文獻(xiàn)3 :國(guó)際公布W02009/057165
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 技術(shù)問題
[0013] 本發(fā)明的目的是提供微囊泡及其制造方法。
[0014] 問題的解決方案
[0015] 本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了勤勉的研究以達(dá)到目的并且因此發(fā)現(xiàn)，使用包含處在端粒酶 逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT)基因啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)基因的慢病毒載體將轉(zhuǎn)基因?qū)爰?xì)胞可以激活轉(zhuǎn) 基因到宿主基因組的整合和其表達(dá)并且可以提高由細(xì)胞產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的微囊泡 等等的細(xì)胞外釋放。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明已經(jīng)完成。
[0016] 具體地，本發(fā)明涵蓋以下方面：
[0017] [1]用于制造微囊泡的方法，所述微囊泡包含：轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物和/或包含轉(zhuǎn)基因的慢 病毒RNA，所述方法包括以下步驟：
[0018] 培養(yǎng)已在體外使用慢病毒載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞以胞外釋放包含所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn) 物和/或所述包含轉(zhuǎn)基因的慢病毒RNA的所述微囊泡，其中所述慢病毒載體是至少一種結(jié) 構(gòu)蛋白基因缺陷的并且在慢病毒基因組序列中包含處于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT)基因啟動(dòng) 子控制下的轉(zhuǎn)基因；以及
[0019] 收集所釋放的微囊泡。
[0020] [2]根據(jù)[1]所述的方法，其中所述細(xì)胞不具有所述至少一種結(jié)構(gòu)蛋白基因。
[0021] [3]根據(jù)[1]或[2]所述的方法，其中所述慢病毒載體是env基因缺陷的。
[0022] [4]根據(jù)[1]至[3]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT)基因 啟動(dòng)子是人類TERT基因啟動(dòng)子。
[0023] [5]根據(jù)[4]所述的方法，其中所述人類TERT基因啟動(dòng)子包含SEQ ID NO: 1的核 苷酸序列或與SEQ ID NO: 1的核苷酸序列具有90%或更高的序列同一性的核苷酸序列。
[0024] [6]根據(jù)[5]所述的方法，其中所述人類TERT基因啟動(dòng)子包含與SEQ ID NO: 1的 核苷酸序列具有95%或更高的序列同一性的核苷酸序列。
[0025] [7]根據(jù)[1]至[6]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述慢病毒RNA包含轉(zhuǎn)基因上游的 TERT基因啟動(dòng)子序列。
[0026] [8]根據(jù)[1]至[7]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述慢病毒載體是：
[0027] (i)包含慢病毒基因組序列的RNA載體，
[0028] (ii)編碼包含慢病毒基因組序列的RNA的DNA載體，或
[0029] (iii)攜帶包含慢病毒基因組序列的RNA的病毒顆粒。
[0030] [9]根據(jù)[1]至[8]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述慢病毒基因組序列包含TERT 基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)基因之間的TERT的轉(zhuǎn)錄區(qū)域的至少一部分。
[0031] [10]根據(jù)[9]所述的方法，其中所述TERT轉(zhuǎn)錄區(qū)域的至少一部分包含SEQ ID N0:2的核苷酸序列或與SEQ ID NO :2的核苷酸序列具有90%或更高的序列同一性的核苷 酸序列。
[0032] [11]根據(jù)[1]至[10]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述慢病毒基因組序列是HIV基 因組序列。
[0033] [12]根據(jù)[11]所述的方法，其中所述HIV基因組序列是HIV-I基因組序列。
[0034] [13]根據(jù)[12]所述的方法，其中所述HIV-I基因組序列包含5'LTR ;包裝信號(hào)Φ ; gag基因；pol基因；vif基因；vpr基因；tat基因；rev基因；vpu基因和3' LTR。
[0035] [14]根據(jù)[1]至[13]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼蛋白質(zhì)或RNA。
[0036] [15]根據(jù)[1]至[14]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述慢病毒載體包含為腫瘤抑制 基因的所述轉(zhuǎn)基因。
[0037] [16]根據(jù)[15]所述的方法，其中所述腫瘤抑制基因是PTEN基因或pl6基因。
[0038] [17]根據(jù)[1]至[14]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述慢病毒載體包含編碼ShRNA 的所述轉(zhuǎn)基因。
[0039] [18]根據(jù)[17]所述的方法，其中所述shRNA靶向編碼細(xì)胞增殖調(diào)控因子的基因。
[0040] [19]根據(jù)[18]所述的方法，其中所述細(xì)胞增殖調(diào)控因子是CDC6。
[0041] [20]根據(jù)[1]至[19]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是人類細(xì)胞。
[0042] [21]根據(jù)[1]至[20]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是腎衍生的細(xì)胞。
[0043] [22]根據(jù)[1]至[21]的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是人胚腎293T細(xì)胞。
[0044] [23] -種微囊泡，包含：轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物和/或包含轉(zhuǎn)基因的慢病毒RNA，其中所述微 囊泡是根據(jù)[1]至[22]的任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的。
[0045] [24]基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，所述方法包括使靶細(xì)胞與根據(jù)[23]所述的包含轉(zhuǎn)基因產(chǎn) 物和/或包含轉(zhuǎn)基因的慢病毒RNA的微囊泡接觸以融合它們，從而將轉(zhuǎn)基因引入細(xì)胞內(nèi)。
[0046] [25]根據(jù)[24]所述的方法，其中使所述靶細(xì)胞與微囊泡在體外接觸。
[0047] [26] -種組合物，包含根據(jù)[23]所述的微囊泡。
[0048] [27] -種藥物組合物，包含根據(jù)[23]所述的微囊泡。
[0049] [28]根據(jù)[27]所述的所述藥物組合物，所述藥物組合物用于治療癌癥。
[0050] [29]根據(jù)[28]所述的藥物組合物，其中所述癌癥選自由以下組成的組：結(jié)腸癌、 胰腺癌、腎癌、肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、甲狀腺癌和惡性淋巴 瘤。
[0051] [30]根據(jù)[28]或[29]所述的藥物組合物，其中所述癌癥涉及⑶C6的表達(dá)升高。
[0052] [31]根據(jù)[27]至[30]的任一項(xiàng)所述的藥物組合物，還包含藥學(xué)上可接受的載體。
[0053] [32] -種治療患者的方法，包括將根據(jù)[23]所述的微囊泡施用于需要導(dǎo)入所述 轉(zhuǎn)基因或所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的所述患者。
[0054] [33]根據(jù)[32]所述的方法，其中所述患者患有癌癥。
[0055] [34]根據(jù)[33]所述的方法，其中所述癌癥選自由以下組成的組：結(jié)腸癌、胰腺癌、 腎癌、肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、甲狀腺癌和惡性淋巴瘤。
[0056] [35]根據(jù)[33]或[34]所述的方法，其中所述癌癥涉及⑶C6的表達(dá)升高。
[0057] 本說明書包括在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)朥S 61/779, 556和US 61/894, 563中的公開內(nèi) 容，本申請(qǐng)要求其的優(yōu)先權(quán)。
[0058] 發(fā)明效果
[0059] 本發(fā)明提供微囊泡及其制造方法。
[0060] 附圖簡(jiǎn)述
[0061] 圖1是具有HIV-I骨架的質(zhì)粒的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。圖IA是pNL4-3的 HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。圖IB是pTHTK的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。
[0062] 圖2示出重組的慢病毒質(zhì)粒載體pRBL0213T和pTHTN。圖2A是顯示pRBL0213T 和pTHTN的質(zhì)粒DNA映射的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道I :pRBL0213T，EcoR I ;泳道2 : pRBL0213T，Mlu I+Xho I ;泳道 3 :pRBL0213T，Nhe I ;泳道 4 :pTHTN，EcoR I ;泳道 5 :pTHTN， Mlu I+Xho I;泳道M:lkb梯。圖2Β是pRBL0213T的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。圖2C是 pTHTN的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。
[0063] 圖3顯示重組的慢病毒質(zhì)粒載體pRBLOOl。圖3A是顯示pRBLOOl的質(zhì)粒DNA映射 的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道I :pRBL001，EcoR I ;泳道2 :pRBL001，EcoR I+Nhe I ;泳道3 : pRBL001，Mlu I+Xho I;泳道 4:pRBL001，Sal I;泳道 5:pRBL0213T，Nhe I;泳道 M:lkb 梯。 圖3B是pRBLOOl的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)RI代表EcoR I、Sal 代表 Sal I、Mlu 代表 Mlu I、Nhe 代表 Nhe I 且 Xho 代表 Xho I。
[0064] 圖4是重組慢病毒質(zhì)粒載體的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。圖4A是pNL4-3 (野 生型HIV-1)的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。圖4B是在HIV-I整合酶中具有突變并且缺乏 將HIV-I病毒基因組的DNA整合入宿主基因組的pD64V的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。圖 4C是pTHTK的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。圖4D是pTHTN的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。 圖4E是缺乏hTERT啟動(dòng)子的5'部分的pTHTH的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。圖4F是具 有來自人巨細(xì)胞病毒（CMV)的啟動(dòng)子序列的pTHTC的HIV-I基因組區(qū)域的示意圖。
[0065] 圖5是顯示制備用于檢測(cè)LTR-標(biāo)簽的Bpm I位點(diǎn)的示意圖。圖5A是顯示于pTHTK 的HIV-I基因組區(qū)域的5' LTR中制備的新的Bpm I位點(diǎn)的示意圖。圖5B是顯示Bpm I限 制性內(nèi)切酶在毗鄰于復(fù)制到HIV-I 3'LTR的Bpm I位點(diǎn)的整合位點(diǎn)（14個(gè)核苷酸）切割宿 主染色體DNA的示意圖。圖5C是慢病毒基因組的末端結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0066] 圖6是顯示通過連接介導(dǎo)的PCR(LM-PCR)來形成LTR-標(biāo)簽的示意圖。
[0067] 圖7是用于檢測(cè)LTR-標(biāo)簽的LM-PCR的凝膠電泳圖。
[0068] 圖8顯示了檢查病毒RNA剪接的結(jié)果。圖8A和8B是顯示使用2. 2 %瓊脂糖凝膠 在lx TAE中使RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳的結(jié)果的照片。圖8A是顯示使用引物5'LTRU5和 3' NL8960獲得的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖。圖8B是顯示使用引物5' LTRU5和3' NL5850獲 得的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖。剪接的RNA片段a(El+Al/3' NL5850)、b (E1+A2/3' NL5850)、 cl(El+E2+E3+A3/3'NL5850)、c2(El+E2+A3/3'NL5850)和 c3(El+E3+A3/3'NL5850)的條帶 的位置被示于圖8B的右側(cè)。圖8C是顯示未剪接的轉(zhuǎn)錄子的示意圖。圖8D是顯示剪接的 RNA的示意圖。在圖8D中，Al至A3表示3'剪接受體且El至E3表示外顯子。
[0069] 圖9是顯示p24測(cè)定結(jié)果的圖表。
[0070] 圖10是顯示用于PTEN測(cè)定中的質(zhì)粒載體的構(gòu)成的圖解。圖IOA顯示在PTEN基 因轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為陰性對(duì)照的PGL3-1375 (Empt.;質(zhì)粒大?。杭s7kb)。圖IOB顯示在PTEN基因 轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為陽性對(duì)照的pcDNA3. l/CMV-hPTEN(Regul.;質(zhì)粒大?。杭s7. 5kb)。圖IOC顯示用 于PTEN基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄載體pRBL016Bn(Retro.;質(zhì)粒大?。杭s7. 9kb)。.圖IOD顯示用 于PTEN基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的重組的慢病毒載體pRBL0213T(Lenti.;質(zhì)粒大小：約15kb)。載體中限 制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH代表BamH I ;Bgl代表Bgl II ;RI代表EcoR I ;RV代表EcoR V ;Hd3 代表 Hind III ;Mlu 代表 Mlu I ;Nco 代表 Nco I ;Nde 代表 Nde I ;Sal 代表 Sal I ;Stu 代表 Stu I;且 Xho 代表 Xho I。
[0071] 圖11是顯示對(duì)利用質(zhì)粒載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的PTEN測(cè)定的結(jié)果的圖表。
[0072] 圖12是顯示在mv裂解物中的PTEN活性與在圖11中所示的細(xì)胞裂解物中的PTEN 活性的比率的圖表。
[0073] 圖13是顯示重組慢病毒顆粒RBL0213T感染的PTEN測(cè)定的結(jié)果的圖表。
[0074] 圖14是顯示mv裂解物中PTEN活性與由重組慢病毒質(zhì)粒載體pRBL0213T轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞或由重組的慢病毒顆粒RBL0213T感染的細(xì)胞的細(xì)胞裂解物中PTEN活性的比率。
[0075] 圖15是顯示在mv中或在與mv孵育的細(xì)胞中病毒蛋白或內(nèi)源蛋白或外源蛋白的 蛋白質(zhì)印記的結(jié)果的照片。圖15A顯示使用抗-Vpu抗體獲取的結(jié)果。圖15B顯示使用 抗-RT抗體獲取的結(jié)果。圖15C顯示使用抗-FEN-I抗體獲取的結(jié)果。
[0076] 圖16是一組顯微鏡照片，顯示被其中包封c-myc-FEN-1的mv遞送內(nèi)含物到細(xì)胞。 圖16A顯示被抗-c-myc抗體染色的圖像。圖16B顯示被DAPI染色的圖像。圖16C顯示圖 16A和16B的重疊圖像。圖16D顯不由Photoshop(R) (Adobe Systems Inc.)的圖像"調(diào)整" 方法中的顏色曲線程序從重疊的圖像制備的圖像。
[0077] 圖17是顯示Lenti_mv2010/CDC6shRNA的癌細(xì)胞增殖抑制效果的圖表。
[0078] 圖18顯示指示細(xì)胞蛋白提取物和mv裂解物中的蛋白質(zhì)印記分析的結(jié)果的照片。
[0079] 圖19顯示表現(xiàn)出通過病理檢查對(duì)來自各測(cè)試組的腫瘤觀察的典型的形態(tài)的照 片。A，陰性對(duì)照組；B，干擾素（IFN) a -2b注射組；C，Cytomox PTEN注射組以及D，Cytomox P53注射組。
[0080] 圖20顯示表現(xiàn)出通過病理測(cè)試對(duì)來自各測(cè)試組的腫瘤觀察的典型的形態(tài)的照 片。A，低劑量Cytomox Ex注射組；B，高劑量Cytomox Ex注射組；C，低劑量Cytomox HD注 射組以及D，高劑量Cytomox HD注射組。
[0081] 實(shí)施方案的描述
[0082] 在下文中，將詳細(xì)描述本發(fā)明。
[0083] 1.制造微囊泡的方法
[0084] 本發(fā)明涉及制造微囊泡的方法。本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0085] 培養(yǎng)已在體外使用慢病毒載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞以胞外釋放微囊泡，所述微囊泡 包含：轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物和/或包含轉(zhuǎn)基因的慢病毒RNA，其中所述慢病毒載體是至少一種結(jié)構(gòu)蛋 白基因缺陷的并且在慢病毒基因組序列中包含處于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT)基因啟動(dòng)子控 制下的轉(zhuǎn)基因，以及
[0086] 收集所釋放的微囊泡。
[0087] 通過本發(fā)明的方法制造的微囊泡包含：轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物和/或包含轉(zhuǎn)基因的慢病毒 RNA。本發(fā)明的方法可以有效地制造包含轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物和/或包含轉(zhuǎn)基因的慢病毒RNA的微 囊泡。
[0088] 根據(jù)本發(fā)明的慢病毒載體指的是用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的具有慢病毒基因組序列作為基 本骨架的載體。慢病毒是具有逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA病毒。慢病毒可以將病毒基因組DNA(前病 毒DNA)整合入宿主的分裂和非分裂細(xì)胞的染色體中從而使病毒衍生的基因可以被宿主細(xì) 胞表達(dá)。慢病毒載體是基于慢病毒的這樣的性質(zhì)。
[0089] 根據(jù)本發(fā)明的慢病毒載體可以是：
[0090] (i)包含慢病毒基因組序列的RNA載體，
[0091] (ii)編碼包含慢病毒基因組序列的RNA的DNA載體，或
[0092] (iii)攜帶包含慢病毒基因組序列的RNA的病毒顆粒。
[0093] ⑴的RNA載體可以，例如，通過體外轉(zhuǎn)錄從包含慢病毒基因組序列的表達(dá)載體或 表達(dá)盒來制備。（ii)的DNA載體可以包括質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體通常包含編碼包含慢病毒基 因組序列的RNA的DNA序列、和用于帶來DNA序列的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子以及終止子、復(fù)制起點(diǎn)以 及用于篩選重組體的標(biāo)記基因等。這樣的DNA載體可以使用基因重組技術(shù)等由本領(lǐng)域已知 的方法來制備。（iii)的病毒顆粒可以是由不同的病毒的包膜蛋白假病毒化的病毒顆粒，所 述不同的病毒的包膜蛋白例如，水皰性口炎病毒（VSV)的包膜糖蛋白G(VSV-G)。假病毒化 的病毒顆粒可以通過例如以下來制備：以編碼包含慢病毒基因組序列的RNA的DNA載體和 編碼不同的病毒的包膜蛋白（例如，VSV-G)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞；收集釋放入培養(yǎng)基 的病毒顆粒；以及純化該顆粒。
[0094] 在本發(fā)明中使用的慢病毒載體在其慢病毒基因組序列中是至少一種病毒結(jié)構(gòu)蛋 白基因缺陷的。這樣的慢病毒基因組序列可以是，其中在全長(zhǎng)慢病毒基因組序列中至少一 種病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因被破壞（例如，通過缺失一部分或全部區(qū)域或者通過插入核酸分子） 的慢病毒基因組序列。在本發(fā)明中，基因中的術(shù)語"缺陷"意指完整基因被缺失或者基因被 破壞或突變使得功能性蛋白不能表達(dá)。慢病毒載體中有缺陷的病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因可以是選 自由gag基因、pol基因和env基因組成的組中的至少一種。gag基因編碼參與病毒顆粒形 成的蛋白。pol基因編碼諸如逆轉(zhuǎn)錄酶（RT)的酶。env基因編碼參與吸附在宿主細(xì)胞上和 穿透宿主細(xì)胞的外殼（包膜）蛋白。例如，慢病毒載體可以是env基因缺陷的。例如，可以 從慢病毒載體中缺失對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:4的位置6344至位置7611的區(qū)域以導(dǎo)致HIV-I的 env基因的缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在基因組中或染色體外不具有在慢病毒載體中有 缺陷的至少一種病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因。已經(jīng)使用慢病毒載體將轉(zhuǎn)基因?qū)肫渲械倪@樣的細(xì)胞 不產(chǎn)生傳染性的慢病毒顆粒。因此，產(chǎn)生的微囊泡是高度安全的。
[0095] 根據(jù)本發(fā)明在慢病毒載體中作為基本骨架使用的慢病毒基因組序列的實(shí)例包括， 但不局限于，來自人免疫缺陷病毒（HIV)、猿猴免疫缺陷病毒（SIV)、貓免疫缺陷病毒（FIV) 和犬免疫缺陷病毒（CIV)的基因組的序列。根據(jù)本發(fā)明的慢病毒基因組序列優(yōu)選地是HIV 基因組序列。更具體地，HIV基因組序列可以是HIV-I或HIV-2基因組序列。優(yōu)選地，HIV 基因組序列可以是HIV-I基因組序列。HIV可以是屬于HIV-I組Μ、Ν、0或P的毒株。更具 體地，HIV 可以是包括 HIV-lIIIb、HIV-lSF2、HIV-lSF162、HIV-lBRU、HIV-lNY5、HIV-lL AI、 HIV-1NL4-3等等的HIV-I毒株的任一種。示范性的HIV基因組序列可以從Genbank登錄號(hào) EU541617、K03455以及K02013等等獲得。慢病毒基因組序列可以是RNA或者可以是DNA。
[0096] 慢病毒載體中的慢病毒基因組序列可以包含5' LTR和3' LTR，和任選地選自由以 下組成的組的至少一個(gè)：包裝信號(hào)Φ、gag基因、pol基因、vif基因、vpr基因、tat基因、 rev基因、vpu基因或vpx基因、nef基因和env基因。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，慢病毒載體中 的HIV-I的慢病毒基因組序列可以包含5'LTR、包裝信號(hào)Φ、gag基因、pol基因、vif基因、 vpr基因、tat基因、rev基因、vpu基因和3' LTR。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，慢病毒載 體中的HIV-2的慢病毒基因組序列可以包含5' LTR、包裝信號(hào)Φ、gag基因、pol基因 、vif 基因、vpr基因、tat基因、rev基因、vpx基因和3' LTR。這樣的慢病毒基因組序列典型地 包含至少一個(gè)剪接供體（SD)和剪接受體（SA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，慢病毒載體中的慢病毒 基因組序列可以包含vpu基因、tat基因和rev基因。慢病毒載體中的慢病毒基因組序列 可以是nef基因缺陷的。
[0097] 根據(jù)本發(fā)明的慢病毒載體在慢病毒基因組序列中包含處于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (TERT)基因啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)基因。TERT是在DNA復(fù)制期間合成端粒重復(fù)段的酶。在本發(fā) 明中使用的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT)基因啟動(dòng)子可以是，但不限于人TERT基因啟動(dòng)子。優(yōu) 選地，人TERT基因啟動(dòng)子可以包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列或者與SEQ ID NO: 1的核苷 酸序列具有90%或更高的序列同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選地，人TERT基因啟動(dòng)子可以包 含與SEQ ID N0:1的核苷酸序列具有95%、97%、99%、99.5%或99.9%或更高的序列同一 性的核苷酸序列。
[0098] 在一個(gè)實(shí)施方案中，還優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的慢病毒載體包含SEQ ID NO: 5的核苷 酸序列或與其具有90%或更高、優(yōu)選地95%或更高、更優(yōu)選地99%或更高，例如，99. 8%或 更高的序列同一性的序列作為慢病毒基因組序列；以及包含TERT基因啟動(dòng)子和已經(jīng)被進(jìn) 一步插入至慢病毒基因組序列（優(yōu)選地在nef基因中）的處于TERT基因啟動(dòng)子控制下的 轉(zhuǎn)基因的序列。
[0099] 在本發(fā)明中，短語"處于TERT基因啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)基因"意指轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄由 TERT基因啟動(dòng)子的活性起始。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因位于TERT基因啟動(dòng)子的下游。
[0100] TERT轉(zhuǎn)錄區(qū)域的至少一部分可存在于TERT基因啟動(dòng)子與插入到慢病毒基因組序 列中的轉(zhuǎn)基因之間。TERT轉(zhuǎn)錄區(qū)域的該至少一部分可至少包括TERT基因的第一外顯子。 TERT轉(zhuǎn)錄區(qū)域的該至少一部分可以包括SEQ ID N0:2的核苷酸序列或者與SEQ ID N0:2的 核苷酸序列具有90 %、95 %、97 %、99 %、99. 5 %或更高的序列同一性的核苷酸序列。
[0101] 本發(fā)明使用的轉(zhuǎn)基因可以編碼任何蛋白質(zhì)或者RNA諸如微RNA (miRNA)、小干擾 RNA(SiRNA)或者短發(fā)夾RNA(shRNA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因可以是腫瘤抑制基因。 腫瘤抑制基因的實(shí)例包括，但不局限于，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的腫瘤抑制基因，諸如P53、 BRCAl、Rb、PTEN以及pl6基因。優(yōu)選地，腫瘤抑制基因可以是PTEN或pl6基因。PTEN蛋白 是催化磷脂酰肌醇3, 4, 5-三磷酸（Ptdlns(3, 4, 5)P3