-F15(空載體）與 10218APII/BAC-F1F15 (PII組分生物合成基因簇體外組裝產(chǎn)物）。
[020引 1. 2菌株培養(yǎng)
[0209] 將始旋鏈霉菌肥CB10218(簡稱10218)、缺失突變株10218APII及互補菌株 10218APII/BAC-F15 (空載體）與10218APII/BAC-F1F15 (PII組分生物合成基因簇體外組 裝產(chǎn)物）分別劃線于RP平板，3(TC靜置培養(yǎng)3-5天，分別挑取等體積的菌塊接種于液體培 養(yǎng)基，27°C240巧m培養(yǎng)48虹，后取樣。
[0210] 1.3原始霉素測定
[0211]吸取培養(yǎng)液800ul，加入等體積丙麗，振蕩后室溫放置60min，12000轉(zhuǎn)離必 5min，取上清，進行HPLC檢測，柱子型號；AgilentEclipse,填料；XDBC185微米，尺寸： 4. 6mmX150mm，波長206皿，流速Iml/min，流動相：己臘；0. 03M皿2?〇4緩沖液=45 ;55。
[021引連輪結(jié)果
[0213] 原始霉素測定的具體結(jié)果見圖3。圖中可W看出，互補菌株10218 APII/ BAC-F15(空載體）不產(chǎn)生原始霉素II，而10218 APII/BAC-F1F15(PII組分生物合成基因 簇體外組裝產(chǎn)物）產(chǎn)生原始霉素II。
[0214]因此，原始霉素II生物合成基因簇體外組裝產(chǎn)物可W部分互補缺失菌株，具有生 理功能。
[021引過:
[0216] 本發(fā)明人利用改進的Gibson組裝方法，在體外成功拼接了來自始旋鏈霉菌的原 始霉素II生物合成基因簇化化b)，證實了所建立方法的有效性。
[0217] 傳統(tǒng)的Gibson等溫一步法不適用于高GC含量DNA大片段組裝，但經(jīng)本發(fā)明人對 其進行了適當(dāng)改進后，可W明顯提高組裝效率并簡化組裝過程。
[0218] 經(jīng)本發(fā)明提供的改良的方法，對于從5化至15化的DNA大片段的體外拼接，DNA的 體外組裝效率從0提升至30%;而對于從15化至45化的DNA大片段的體外拼接，DNA的體 外組裝效率也提高值20%。
[0219] 本發(fā)明提供的方法為放線菌中天然藥物的生物合成基因簇的體外組裝提供了良 好的中間技術(shù)，可初步用于為提高重要天然藥物的發(fā)酵產(chǎn)量、W及新活性天然藥物的挖掘 等領(lǐng)域。
[0220] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考郝樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 W對本發(fā)明作各種改動或修改，送些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的。
【主權(quán)項】
1. 一種靶核酸序列的體外組裝方法，其特征在于，包括步驟： (a)提供用于拼接的n個結(jié)構(gòu)單元，各結(jié)構(gòu)單元的序列記為Ln，其中所述的n為> 2的 正整數(shù)；和線性化的載體元件； 其中， (i) 所述的n個所述結(jié)構(gòu)單元可拼接成式I所示結(jié)構(gòu)的、兩端分別帶有第一和第二重疊 區(qū)以及第一和第二限制性內(nèi)切酶酶切位點的第一級拼接序列： L1-L2-L3-----LN(I) 式中， L1、L2、……、Ln為各結(jié)構(gòu)單元的核苷酸序列； 并且，位于第一級拼接序列的5'端的Ll具有從5'至3'方向的式II所示的結(jié)構(gòu)：X0-X1-X2-X3-L1' (II) 式中， XO為無或任意的長度為I-IOObp核苷酸序列； Xl為第一重疊區(qū)； X2為第一限制性內(nèi)切酶酶切位點； X3為無或任意的長度為l-20bp核苷酸序列； L1'為待保留的拼接單兀序列； 其中，X0-X1-X2-X3構(gòu)成位于5'端的第一側(cè)翼序列； 并且，位于第一級拼接序列的3'端的Ln具有從5'至3'方向的式III所示的結(jié)構(gòu)：Ln，-X4-X5-X6-X7 (III) 式中， X7為無或任意的長度為I-IOObp核苷酸序列； X6為第二重疊區(qū)； X5為第二限制性內(nèi)切酶酶切位點； X4為無或任意的長度為l-20bp核苷酸序列； Ln'為待保留的拼接單兀序列； 其中，X4-X5-X6-X7構(gòu)成位于3'端的第二側(cè)翼序列； 并且，第一重疊區(qū)和第二重疊區(qū)是互不相同的，且GC含量為0-50% ; (ii) 所述線性化的載體元件的結(jié)構(gòu)如式IV所示， X0b-Xlb-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(IV) 式中， XOb為XO的互補序列； Xlb為Xl的互補序列，即第一重疊區(qū)的互補序列； X2b為所述的第二限制性內(nèi)切酶酶切位點； X3b為X3的互補序列； Z為載體的結(jié)構(gòu)序列； X4b為X4的互補序列； X5b為所述第二限制性內(nèi)切酶酶切位點；； X6b為X6的互補序列，即第二重疊區(qū)的互補序列； X7b為X7的互補序列； (b) 在外切酶、聚合酶和/或連接酶酶存在下，使上述的n個結(jié)構(gòu)單元和線性化的載體 元件進行組裝，從而形成式V所述的第一級連接產(chǎn)物，其中所述連接產(chǎn)物為環(huán)狀； L1-L2-L3-----Ln-X0b-Xlb-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(V) 式中，Ll、L2、L3、Ln、X0b、Xlb、X2b、X3b、Z、X4b、X5b、X6b、X7b的定義如上所述； (c) 任選地用所述的第一限制性內(nèi)切酶和/或第二限制性內(nèi)切酶上一步驟的連接產(chǎn) 物，從而獲得用于下一級組裝的結(jié)構(gòu)單元；并且任選地重復(fù)步驟（a)和步驟（b)共j次，從 而形成j+1級組裝產(chǎn)物，其中j為彡1的正整數(shù)。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，X0、X3、X4、和X7中的一個或多個為無。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，乂013 3313 3413、和乂713中的一個或多個為無。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一側(cè)翼序列為SEQIDNO. : 1和/或 所述的第二側(cè)翼序列為SEQIDNO. :2。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸序列為放線菌的核苷酸序列。6. -種用于DNA體外組裝的構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物包括： 用于拼接的n個結(jié)構(gòu)單元，各結(jié)構(gòu)單元的序列記為Ln，其中所述的n為> 2的正整數(shù)； 和 線性化的載體元件； 其中， (i)所述的n個所述結(jié)構(gòu)單元可拼接成式I所示結(jié)構(gòu)的、兩端分別帶有第一和第二重疊 區(qū)以及第一和第二限制性內(nèi)切酶酶切位點的第一級拼接序列： LfL2-L3-----Ln (I) 式中， L1、L2、……、Ln為各結(jié)構(gòu)單元的核苷酸序列； 并且，位于第一級拼接序列的5'端的Ll具有從5'至3'方向的式II所示的結(jié)構(gòu)：X0-X1-X2-X3-L1' (II) 式中， XO為無或任意的長度為I-IOObp核苷酸序列； Xl為第一重疊區(qū)； X2為第一限制性內(nèi)切酶酶切位點； X3為無或任意的長度為l-20bp核苷酸序列； L1'為待保留的拼接單兀序列； 其中，X0-X1-X2-X3構(gòu)成位于5'端的第一側(cè)翼序列； 并且，位于第一級拼接序列的3'端的Ln具有從5'至3'方向的式III所示的結(jié)構(gòu)：Ln，-X4-X5-X6-X7 (III) 式中， X7為無或任意的長度為I-IOObp核苷酸序列； X6為第二重疊區(qū)； X5為第二限制性內(nèi)切酶酶切位點； X4為無或任意的長度為l-20bp核苷酸序列； Ln'為待保留的拼接單兀序列； 其中，X4-X5-X6-X7構(gòu)成位于3'端的第二側(cè)翼序列； 并且，第一重疊區(qū)和第二重疊區(qū)是互不相同的，且GC含量為0-50% ; (ii)所述線性化的載體元件的結(jié)構(gòu)如式IV所示，X0b-Xlb-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(IV) 式中， XOb為XO的互補序列； Xlb為Xl的互補序列，即第一重疊區(qū)的互補序列； X2b為所述的第二限制性內(nèi)切酶酶切位點； X3b為X3的互補序列； Z為載體的結(jié)構(gòu)序列； X4b為X4的互補序列； X5b為所述第二限制性內(nèi)切酶酶切位點；； X6b為X6的互補序列，即第二重疊區(qū)的互補序列； X7b為X7的互補序列。7. -種用于DNA體外組裝的載體，其特征在于，所述載體是線性化的載體元件，或所述 載體經(jīng)酶切后可形成所述的線性化的載體元件； 其中，所述線性化的載體元件的結(jié)構(gòu)如式IV所示，X0b-Xlb-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(IV) 式中， XOb為XO的互補序列； Xlb為Xl的互補序列，即第一重疊區(qū)的互補序列； X2b為所述的第二限制性內(nèi)切酶酶切位點； X3b為X3的互補序列； Z為載體的結(jié)構(gòu)序列； X4b為X4的互補序列； X5b為所述第二限制性內(nèi)切酶酶切位點；； X6b為X6的互補序列，即第二重疊區(qū)的互補序列； X7b為X7的互補序列。8. -種權(quán)利要求6所述的用于DNA體外組裝的構(gòu)建物或權(quán)利要求7所述的用于DNA體 外組裝的載體的用途，其特征在于，用于高GC含量的大片段DNA的體外組裝。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種DNA體外組裝方法，具體地，本發(fā)明涉及高GC含量大片段DNA的體外組裝方法及應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明人利用改進的Gibson組裝方法，在體外成功拼接了來自始旋鏈霉菌的原始霉素II生物合成基因簇，其可適用于高GC含量DNA大片段組裝，并可以明顯提高組裝效率并簡化組裝過程。
【IPC分類】C12N15/66, C12N15/10, C12N15/63
【公開號】CN105200035
【申請?zhí)枴緾N201410270968
【發(fā)明人】姜衛(wèi)紅, 李雷, 蘆銀華, 戈梅, 楊晟
【申請人】中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2014年6月17日