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高gc含量大片段dna的體外組裝方法及應(yīng)用_3

文檔序號:9447732閱讀:來源:國知局
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[0151] (3化.coliEPI300電轉(zhuǎn)感受態(tài)高效制備方法
[0152] 1)挑EPI300單菌落接入SOB液體試管中,37°C過夜培養(yǎng);
[0153]。轉(zhuǎn)接200ill菌液至含有200mlSOB的500ml搖瓶中(一次3個),37度培養(yǎng) 2-3h,至孤550 = 0. 5 ;
[0154] 3)離必收集菌體,10 %甘油洗涂2-3次,最后重懸至0D550 = 200-250,大約 400y1/每200血菌液;
[01巧]4)分裝30y1/管,保存于-8(TC。
[0156] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0157]本發(fā)明采用了改進(jìn)了Gibson組裝方法,使組裝效率從0提升至20-30 %,從而建立 了一種適用于高GC含量DNA大片段的組裝方法;同時,由于使用了通用的載體與片段間的 重疊區(qū)片段,所W不再像原有Gibson組裝方法,需要每一步擴(kuò)增載體,即每次組裝時均可 采用相同載體,極大地提高了重組效率。
[0158] 下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,送些實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法,通常按照常規(guī) 條件如Sambrook等人,分子克??;實(shí)驗室手冊(New化rk:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0159] 菌株、質(zhì)粒與試劑:
[0160] 本發(fā)明涉及始旋鏈霉菌Streptomycespristinaespiralis肥CB10218,于 2011 年 11月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中必(CGMCC),保藏號CGMCC NO. 5486。E.coliEPI300 (用于大片段體內(nèi)拼接)購自Epicentre公司。E.coliS17-1 (用 于接合轉(zhuǎn)移)購自BiomedalLifeScience公司。
[0161] 本發(fā)明中pSET152與pKCl139均購自中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中必)。 pCClBAC購自于Elpicentre公司。
[0162] 本發(fā)明中使用的DNA膠回收純化W及質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司, E,Z,E沒,游'BAC/PACDNAKit購自O(shè)megaBio-Tek公司。限制性內(nèi)切酶NdeI,MleI,Sph I與MluI購自化rmentas公司(用于圖3B中酶切鑒定);Taq連接酶與化usionDNA聚合 酶購自肥B公司,巧核酸外切酶與CopyControl?InductionSolution購自Epicentre公 司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。
[0163] 培養(yǎng)基:
[0164] 1.液體LB培養(yǎng)基(1L)
[0165] 蛋白腺lOg、酵母提取物5g、化CllOg、蒸傭水1L;12rC滅菌20分鐘。
[0166] 2.固體LB培養(yǎng)基(1L)
[0167] 蛋白腺lOg、酵母提取物5g、化CllOg、瓊脂粉20g、蒸傭水1L;12rC滅菌20分鐘。
[016引 3.液體SOB培養(yǎng)基(1L)
[0169] 蛋白腺20g、酵母粉5g、氯化鋼0. 5g、氯化鐘0. 186g、蒸傭水1L、用氨氧化鋼調(diào)節(jié) 抑至7. 0 ;12TC滅菌20分鐘。
[0170] 4.液體S0C培養(yǎng)基
[017。 液體SOB培養(yǎng)基添加20mM葡萄糖;12rC滅菌20分鐘。
[0172] 5.液體RP培養(yǎng)基配方(1L)
[0173] 可溶性淀粉lOg、葡萄糖lOg、黃豆粉15g、酵母粉5g、KN032. 5g、化Cllg、CaC〇34g; 蒸傭水IL。調(diào)抑7. 0~7. 2,12rC滅菌20分鐘。
[0174] 6.固體RP培養(yǎng)基配方(1L)
[0175] 可溶性淀粉 20g、黃豆餅粉lOg、化C12g、KH2PO4O. 5g、M拆〇4. 7H2〇lg、CaC〇33g、瓊脂 粉20g、蒸傭水1L;調(diào)P冊.4,12rC滅菌20分鐘。
[0176] 7.始旋鏈霉菌種子培養(yǎng)基(1L)
[0177] 可溶性淀粉lOg,葡萄糖lOg,黃豆粉15g,酵母粉5g,KN032. 5g,化Cllg,CaC〇34g。 先將淀粉用熱水糊化,加入其它原料,定容,調(diào)pH7. 0~7. 2,最后加入碳酸巧,攬拌均勻,分 裝滅菌。
[0178] 8.始旋鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)
[0179] 可溶性淀粉lOg,葡萄糖15g,黃豆粉25g,酵母粉3. 5g,棉巧蛋白粉5gKH2P〇4〇. 1邑, M拆〇4?7H2〇2g,。先將淀粉用熱水糊化,再加入其它原料,定容,調(diào)P冊.0,然后加入碳酸巧 6邑,攬拌均勻,分裝滅菌。
[0180] 實(shí)施例1
[0181] 改進(jìn)的Gibson組裝方法與原有方法組裝效率對比
[0182] 前期,采用Gibson等溫一步法直接組裝來自于原始霉素II生物合成基因簇中的 3個片段(F7-F9,尺度均大約5化,其中,各片段的GC含量均大于70%),載體基本全部自 連,組裝效率為0。更換其他一組3個片段(F10-F12,尺度均大約5化,各片段的GC含量為 均大于70 %)進(jìn)行組裝,結(jié)果類似(圖2)。該實(shí)驗結(jié)果提示,高GC含量重疊區(qū)(GC含量約 75% )導(dǎo)致如此低的組裝效率。
[0183] 于是本發(fā)明人對原有方法進(jìn)行了如下改進(jìn)(圖1):
[0184] 1)針對鏈霉菌基因組高GC含量的特點(diǎn),此次設(shè)計主要在載體pCClBAC或片段兩側(cè) 添加2化P富含A或者AG的接頭(序列如SEQIDNO. : 1和2所示),W降低載體自連頻率, 提高組裝效率,其中序列如下:
[0185]SEQIDNO. :1:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT;
[0186]SEQIDNO. :2:TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC。
[0187] 2)由于使用了相同的載體與片段間重疊區(qū),所W不再像原有Gibson組裝方法,需 要每一步擴(kuò)增載體,即每次組裝時均可采用相同載體;
[0188] 3)重疊區(qū)兩側(cè)設(shè)計了兩個相互交錯的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(NdeI和化eI),W 獲得上一級的組裝產(chǎn)物,實(shí)現(xiàn)等級化拼接。
[0189] 本發(fā)明人采用改進(jìn)方法,對上述兩組片段(從5化至15化)進(jìn)行了組裝,結(jié)果如表 1所示;組裝效率從原有的0提升至30%。在下一級組裝過程中(從15化至45化),效率 為20%。每一次組裝結(jié)果均隨機(jī)挑選20個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定,兩次生物學(xué)重復(fù)。
[0190] 表1組裝效率結(jié)果的總結(jié)
[0191]
[0192] 其中,本實(shí)施例1和實(shí)施例2中所采用的各拼接元件的GC含量如表2所示。
[0193] 表2拼接元件的GC含量
[0194]
[0195]
[0196] 實(shí)施例2
[0197] 改進(jìn)的組裝方法用于拼接原始霉素II生物合成基因簇
[0198] 利用改進(jìn)的Gibson組裝方法,對始旋鏈霉菌原始霉素II生物合成基因簇進(jìn)行 了體外拼接。組裝等級化模式如圖3,其組裝過程分為3級。其中出發(fā)片段F1-F14來源 于基因簇本身(來源于始旋鏈霉菌工業(yè)菌肥CB10218),而片段F15來源于載體PSET152, 主要包含接合轉(zhuǎn)移相關(guān)元件(整合酶地iC31、整合位點(diǎn)attP、穿梭元件or口與阿普霉素 抗性基因)。按照實(shí)施例1中介紹的組裝方法,成功獲得了原始霉素II生物合成基因簇 (PCC1BAC-F1F15),采用四種酶進(jìn)行鑒定,結(jié)果與預(yù)期一致。
[0199] 最后,本發(fā)明人對其全長進(jìn)行了測序,與預(yù)測的序列相符。送表明,采用本發(fā)明的 拼接方法,可高效拼接獲得完整的原始霉素II生物合成基因簇。
[0200] 實(shí)施例3
[0201] PII生物合成基因簇體外組裝產(chǎn)物的功能互補(bǔ)
[0202] 1. 1PII合成基因簇主要部分巧4化/67化)的敲除
[0203] 為驗證獲得的Pn生物合成基因簇的體外組裝產(chǎn)物度AC-F1F15)是否具有生理功 能,在本實(shí)驗中,敲除了pn合成基因簇主要部分(基因簇呈離散分布,一段大小為13化,另 一段大小為54化,此次敲除了54化的主要片段)。敲除方法采用地C1139介導(dǎo)的同源重組 策略,同時借助了I-scel歸巢內(nèi)切酶。該酶可W在同源重組時促進(jìn)DNA單鏈缺口的產(chǎn)生, 提高雙交換效率。成功獲得了PII合成基因簇主要部分的缺失突變株10218 A PII,PCR驗 證結(jié)果未顯7JK。
[0204] 發(fā)酵結(jié)果如圖3所示:原始霉素I與II均不再合成,說明原始霉素II組分合成基 因簇成功敲除,并且敲除對原始霉素I的合成也有影響。
[0205] 1. 2PII生物合成基因簇體外拼接產(chǎn)物導(dǎo)入10218 A PII
[0206] 將實(shí)施例2中含有組裝并經(jīng)修復(fù)的PII生物合成基因簇體外組裝片段重組質(zhì) 粒pCClBAC-FlF15(實(shí)施例2中構(gòu)建)首先轉(zhuǎn)化入大腸桿菌S17-U購自BiomedalLife Science公司),然后通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入步驟1. 1中制備的缺失突變株10218APII。W空載 體導(dǎo)入10218APII作為陽性及陰性對照。
[0207] 最終獲得2株重組菌株,分別是互補(bǔ)菌株10218APII/BAC
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