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[0151] (3化.coliEPI300電轉(zhuǎn)感受態(tài)高效制備方法
[0152] 1)挑EPI300單菌落接入SOB液體試管中，37°C過夜培養(yǎng)；
[0153]。轉(zhuǎn)接200ill菌液至含有200mlSOB的500ml搖瓶中（一次3個），37度培養(yǎng) 2-3h，至孤550 = 0. 5 ;
[0154] 3)離必收集菌體，10 %甘油洗涂2-3次，最后重懸至0D550 = 200-250,大約 400y1/每200血菌液；
[01巧]4)分裝30y1/管，保存于-8(TC。
[0156] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0157]本發(fā)明采用了改進(jìn)了Gibson組裝方法，使組裝效率從0提升至20-30 %，從而建立 了一種適用于高GC含量DNA大片段的組裝方法；同時，由于使用了通用的載體與片段間的 重疊區(qū)片段，所W不再像原有Gibson組裝方法，需要每一步擴(kuò)增載體，即每次組裝時均可 采用相同載體，極大地提高了重組效率。
[0158] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，送些實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī) 條件如Sambrook等人，分子克??；實(shí)驗室手冊（New化rk:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0159] 菌株、質(zhì)粒與試劑：
[0160] 本發(fā)明涉及始旋鏈霉菌Streptomycespristinaespiralis肥CB10218,于 2011 年 11月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中必（CGMCC)，保藏號CGMCC NO. 5486。E.coliEPI300 (用于大片段體內(nèi)拼接）購自Epicentre公司。E.coliS17-1 (用 于接合轉(zhuǎn)移）購自BiomedalLifeScience公司。
[0161] 本發(fā)明中pSET152與pKCl139均購自中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中必）。 pCClBAC購自于Elpicentre公司。
[0162] 本發(fā)明中使用的DNA膠回收純化W及質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司， E,Z，E沒,游'BAC/PACDNAKit購自O(shè)megaBio-Tek公司。限制性內(nèi)切酶NdeI，MleI，Sph I與MluI購自化rmentas公司（用于圖3B中酶切鑒定）；Taq連接酶與化usionDNA聚合 酶購自肥B公司，巧核酸外切酶與CopyControl?InductionSolution購自Epicentre公 司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。
[0163] 培養(yǎng)基：
[0164] 1.液體LB培養(yǎng)基（1L)
[0165] 蛋白腺lOg、酵母提取物5g、化CllOg、蒸傭水1L;12rC滅菌20分鐘。
[0166] 2.固體LB培養(yǎng)基（1L)
[0167] 蛋白腺lOg、酵母提取物5g、化CllOg、瓊脂粉20g、蒸傭水1L;12rC滅菌20分鐘。
[016引 3.液體SOB培養(yǎng)基（1L)
[0169] 蛋白腺20g、酵母粉5g、氯化鋼0. 5g、氯化鐘0. 186g、蒸傭水1L、用氨氧化鋼調(diào)節(jié) 抑至7. 0 ;12TC滅菌20分鐘。
[0170] 4.液體S0C培養(yǎng)基
[017。 液體SOB培養(yǎng)基添加20mM葡萄糖；12rC滅菌20分鐘。
[0172] 5.液體RP培養(yǎng)基配方（1L)
[0173] 可溶性淀粉lOg、葡萄糖lOg、黃豆粉15g、酵母粉5g、KN032. 5g、化Cllg、CaC〇34g; 蒸傭水IL。調(diào)抑7. 0~7. 2,12rC滅菌20分鐘。
[0174] 6.固體RP培養(yǎng)基配方（1L)
[0175] 可溶性淀粉 20g、黃豆餅粉lOg、化C12g、KH2PO4O. 5g、M拆〇4. 7H2〇lg、CaC〇33g、瓊脂 粉20g、蒸傭水1L;調(diào)P冊.4,12rC滅菌20分鐘。
[0176] 7.始旋鏈霉菌種子培養(yǎng)基（1L)
[0177] 可溶性淀粉lOg，葡萄糖lOg，黃豆粉15g，酵母粉5g，KN032. 5g，化Cllg，CaC〇34g。 先將淀粉用熱水糊化，加入其它原料，定容，調(diào)pH7. 0~7. 2,最后加入碳酸巧，攬拌均勻，分 裝滅菌。
[0178] 8.始旋鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基（1L)
[0179] 可溶性淀粉lOg，葡萄糖15g，黃豆粉25g，酵母粉3. 5g，棉巧蛋白粉5gKH2P〇4〇. 1邑， M拆〇4?7H2〇2g，。先將淀粉用熱水糊化，再加入其它原料，定容，調(diào)P冊.0,然后加入碳酸巧 6邑，攬拌均勻，分裝滅菌。
[0180] 實(shí)施例1
[0181] 改進(jìn)的Gibson組裝方法與原有方法組裝效率對比
[0182] 前期，采用Gibson等溫一步法直接組裝來自于原始霉素II生物合成基因簇中的 3個片段（F7-F9,尺度均大約5化，其中，各片段的GC含量均大于70%)，載體基本全部自 連，組裝效率為0。更換其他一組3個片段（F10-F12,尺度均大約5化，各片段的GC含量為 均大于70 %)進(jìn)行組裝，結(jié)果類似（圖2)。該實(shí)驗結(jié)果提示，高GC含量重疊區(qū)（GC含量約 75% )導(dǎo)致如此低的組裝效率。
[0183] 于是本發(fā)明人對原有方法進(jìn)行了如下改進(jìn)（圖1):
[0184] 1)針對鏈霉菌基因組高GC含量的特點(diǎn)，此次設(shè)計主要在載體pCClBAC或片段兩側(cè) 添加2化P富含A或者AG的接頭（序列如SEQIDNO. : 1和2所示），W降低載體自連頻率， 提高組裝效率，其中序列如下：
[0185]SEQIDNO. :1:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT;
[0186]SEQIDNO. :2:TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC。
[0187] 2)由于使用了相同的載體與片段間重疊區(qū)，所W不再像原有Gibson組裝方法，需 要每一步擴(kuò)增載體，即每次組裝時均可采用相同載體；
[0188] 3)重疊區(qū)兩側(cè)設(shè)計了兩個相互交錯的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（NdeI和化eI)，W 獲得上一級的組裝產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)等級化拼接。
[0189] 本發(fā)明人采用改進(jìn)方法，對上述兩組片段（從5化至15化）進(jìn)行了組裝，結(jié)果如表 1所示；組裝效率從原有的0提升至30%。在下一級組裝過程中（從15化至45化），效率 為20%。每一次組裝結(jié)果均隨機(jī)挑選20個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，兩次生物學(xué)重復(fù)。
[0190] 表1組裝效率結(jié)果的總結(jié)
[0191]
[0192] 其中，本實(shí)施例1和實(shí)施例2中所采用的各拼接元件的GC含量如表2所示。
[0193] 表2拼接元件的GC含量
[0194]
[0195]
[0196] 實(shí)施例2
[0197] 改進(jìn)的組裝方法用于拼接原始霉素II生物合成基因簇
[0198] 利用改進(jìn)的Gibson組裝方法，對始旋鏈霉菌原始霉素II生物合成基因簇進(jìn)行 了體外拼接。組裝等級化模式如圖3,其組裝過程分為3級。其中出發(fā)片段F1-F14來源 于基因簇本身（來源于始旋鏈霉菌工業(yè)菌肥CB10218)，而片段F15來源于載體PSET152， 主要包含接合轉(zhuǎn)移相關(guān)元件（整合酶地iC31、整合位點(diǎn)attP、穿梭元件or口與阿普霉素 抗性基因）。按照實(shí)施例1中介紹的組裝方法，成功獲得了原始霉素II生物合成基因簇 (PCC1BAC-F1F15)，采用四種酶進(jìn)行鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致。
[0199] 最后，本發(fā)明人對其全長進(jìn)行了測序，與預(yù)測的序列相符。送表明，采用本發(fā)明的 拼接方法，可高效拼接獲得完整的原始霉素II生物合成基因簇。
[0200] 實(shí)施例3
[0201] PII生物合成基因簇體外組裝產(chǎn)物的功能互補(bǔ)
[0202] 1. 1PII合成基因簇主要部分巧4化/67化）的敲除
[0203] 為驗證獲得的Pn生物合成基因簇的體外組裝產(chǎn)物度AC-F1F15)是否具有生理功 能，在本實(shí)驗中，敲除了pn合成基因簇主要部分（基因簇呈離散分布，一段大小為13化，另 一段大小為54化，此次敲除了54化的主要片段）。敲除方法采用地C1139介導(dǎo)的同源重組 策略，同時借助了I-scel歸巢內(nèi)切酶。該酶可W在同源重組時促進(jìn)DNA單鏈缺口的產(chǎn)生， 提高雙交換效率。成功獲得了PII合成基因簇主要部分的缺失突變株10218 A PII，PCR驗 證結(jié)果未顯7JK。
[0204] 發(fā)酵結(jié)果如圖3所示：原始霉素I與II均不再合成，說明原始霉素II組分合成基 因簇成功敲除，并且敲除對原始霉素I的合成也有影響。
[0205] 1. 2PII生物合成基因簇體外拼接產(chǎn)物導(dǎo)入10218 A PII
[0206] 將實(shí)施例2中含有組裝并經(jīng)修復(fù)的PII生物合成基因簇體外組裝片段重組質(zhì) 粒pCClBAC-FlF15(實(shí)施例2中構(gòu)建）首先轉(zhuǎn)化入大腸桿菌S17-U購自BiomedalLife Science公司），然后通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入步驟1. 1中制備的缺失突變株10218APII。W空載 體導(dǎo)入10218APII作為陽性及陰性對照。
[0207] 最終獲得2株重組菌株，分別是互補(bǔ)菌株10218APII/BAC