(ThermoScientific,Wilmington,DE0 ;BDH度DH 化學(xué)品，從VWRInternational,liX,Ra化or,PA可得）；Roche(RocheApplied Science,Pleasanton,CA) ;FI0PC(超過陽性對照的成倍改進(jìn)）；ARS(ARS培養(yǎng)物保 藏或NRRL培養(yǎng)物保藏，Peoria,IL) ;ATCC(Ame;ricanTypeQiltureCollection, Manassus,VA) ；ADM(ArcherDanielsMidland,Decatur,IL) ；Axygen(Axygen,Inc.,Union City,CA) ;GenScript(GenScript,USAInc. ,Piscataway,NJ) ；CGSC(E.coli GeneticStockCenter，YaleUniversity,NewHaven,CT) ;HE防CULASE較是AgilentTechnologies(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)白勺注冊商標(biāo)；Dual Biosystems(DualBiosystemsAG,Schlieven,Switzerland) ;Megazyme(Megazyme InternationalIreland,Ltd.，Wicklow,Ireland) ；Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO) ；BASF(BASFAktiengesellschaftCorp.，Ludwigshafen,DE) ；Dasgip(Dasgip Biotools，LLC,Shrewsbury,MA) ;Difco(DifcoLaboratories,BDDiagnostic Systems,Detroit,MI);PCR診斷法巧CR診斷法，由EcoliSRO,SlovakRepublic); Agilent(AgilentTechnologies,Inc.，SantaClara,CA);MolecularDecives(Molecular Decives，Sunnyvale,CA);Symbio(Symbio,Inc.，MenloPark,CA) ;Newport(Newport Scientific,Australia) ;Bi0-民ad(Bio-民adLaboratories,Hercules,CA) ;Qiagen(Qiagen SciencesInc.，Germantown,MA) ；Zymo(ZymoResearchCorporation,Irvine,CA); Promega(PromegaCorporation,Madison,WI) ;Invitrogen(Invitrogen,Inc.，Carlsbad, CA);NEB(NewEnglandBioLabs,Ipswich,M) ;Sensient(SensientBio-Ingredients，Ind ianapolis,IN);AlfaAesar(AlfaAesar,WardHill,MA) ；Calbiochem(EMDBiosciences Inc.，SanDiego,CA)；Mal1inckrodt(Mai1inckrodtBakerInc.St.Louis,MO,現(xiàn)在 AvantorPerformanceMaterials,CenterValley,PA);JTBakerMallinckrodtBaker Inc.，St.Louis,MO，現(xiàn)在AvantorPerformanceMaterials,CenterValley,PA);Corn Products(CornProductsInternational,Stockton,CA);RichmanChemical(民ichman ChemicalInc.，LowerGwynedd,PA) ;0mnipur(Omnipur，Caldwell,ID;從EMDBiosciences Inc.，SanDiego,CA可得）；AMRESCO(AMRESCOUX，Solon,OH) ;Michrom(Michrom Bioresources，Inc.，Auburn，CA) ；LB(Luria-Bertani) ；LA(Luria-Bertani瓊月g) ；S0C(具 有分解代謝物阻遏的SuperOptimaU夜體培養(yǎng)基）；和TB(TerrificBro化）。
[0123] 一種用于定量總脂肪醇的方法，并通過在F15B-8巧OC轉(zhuǎn)子中，在6000巧111下，離屯、 持續(xù)10分鐘來收集使用不同鏈長的每個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞團(tuán)重懸在0. 5mL的6. 7%Na^SO^中， 并且然后用ImL異丙醇：甲基叔下基離（4/6比率）提取持續(xù)2小時(shí)。對提取物離屯、并直 接地通過GC-門D或GC-MS分析或在分析之前用BSTFA衍生化。為了衍生化，對400UL樣 品移去頂部有機(jī)層，在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)并在37它下用100uLN，〇-二（蘭甲基娃烷基）蘭氣乙 醜胺化STFA)對殘留物衍生化持續(xù)1小時(shí)，并且然后在通過GC-門D或GC-MS分析之前，用 100UL庚焼稀釋。還用ImL甲基叔下基離對0.5mL培養(yǎng)基（在通過離屯、去除細(xì)胞之后）提 取持續(xù)Ihr。有機(jī)相直接地通過GC-門D或GC-MS分析或在分析之前如上描述的用BSTFA 衍生化。另外，直接地用ImL異丙醇：己焼（4:6的比率）對0. 5mL細(xì)胞培養(yǎng)物（在通過離 屯、去除細(xì)胞之前）提取持續(xù)2小時(shí)。有機(jī)相直接通過GC-門D或GC-MS分析或在分析之前 如上描述的用BSTFA衍生化。
[0124] 利用下條件通過GC-門D用分流比1:10來分析1化樣品：來自Agilent Technologies的裝備有門D檢測器和HP-5柱（長30m，I.D. 0? 32mm，薄膜0? 25um)的 GC-6890N。GC方法lOCrC開始，25它/min的速率將溫度增加到246它并保持持 續(xù)1.96min?？偟倪\(yùn)行時(shí)間，7.8min。在上GC條件下，產(chǎn)生的脂肪醇和酸的大概的 保留時(shí)間如下：5. 08，C14:0-0H;5. 40;C14:0-00H;5. 74，C16:1-0H;5. 93，C16:0-0H; 6.11，（：16:0-0016(內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)）；6.16，（：16:1-0(^;6.29，（：16:0-0(^;6.80，（：18:1-(?; 6. 90，C18:0-0H;7. 3，C18:0-和C18:1-00H。通過與商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（Sigma)相比完成個(gè)體脂肪醇 的鑒定。
[0125] 實(shí)施例1
[0126] 設(shè)計(jì)并克隆合成的啟動(dòng)子化〇1
[0127] 該實(shí)施例描述了包含兩個(gè)化oB結(jié)合位點(diǎn)（PhoB框）的大腸桿菌合成啟動(dòng)子的設(shè) 計(jì)和克隆。在該構(gòu)造中，運(yùn)些化oB框中的一個(gè)與啟動(dòng)子的-35區(qū)重疊，在本文中該化oB框 被稱為"化〇1啟動(dòng)子"。該設(shè)計(jì)包含的其他特征包括：上游轉(zhuǎn)錄終止子W使啟動(dòng)子與上游啟 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄隔絕；共有的-35和-10區(qū)W增強(qiáng)RNA聚合酶結(jié)合；源于來自rrnB基因的P1啟 動(dòng)子的27bpW促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始；源自rrnB基因的7化P，包含抗-終止信號；包含信號的73bp W增強(qiáng)信使RNA的翻譯；和與lacI-LacZ基因同源的區(qū)域。
[0128]W下提供了合成啟動(dòng)子的DNA的核巧酸序列：
[0130] 合成該合成DNA并通過GenScript在eJETI-2質(zhì)粒中克隆入EcoRV位點(diǎn)。
[0131] 實(shí)施例2
[0132] 構(gòu)建DNAS盒W用化〇1啟動(dòng)子控制f油B
[0133] 該實(shí)例描述了用化〇1啟動(dòng)子控制化bB的DNAS盒的構(gòu)建。該啟動(dòng)子盒被設(shè)計(jì)通過 用卡那霉素-Phol啟動(dòng)子盒置換化bB原始調(diào)控區(qū)來基于培養(yǎng)基中的憐酸鹽水平調(diào)節(jié)化bB 的表達(dá)水平。該盒包含與大腸桿菌化bB基因同源的區(qū)域的40bp和3化P，W及化〇1啟動(dòng) 子和側(cè)翼為FLP重組酶祀位點(diǎn)（"FRT位點(diǎn)"）的卡那霉素抗性基因，如圖2所顯示的。FRT 位點(diǎn)的存在有利于Km標(biāo)志物通過FLP重組酶的作用移除。
[0134] 利用在實(shí)施例1中描述的rJETI中克隆的化01-啟動(dòng)子，通過3步驟PCR組裝該 盒。W下引物和條件被用于獲得該盒。
[0135] 在第一步驟中，使用包含與卡那霉素盒（包含F(xiàn)RT位點(diǎn)）同源的33個(gè)堿基的正向 寡核巧酸（5'CDX-PholF)(SEQIDN0:9)W及包含與原始f油B核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS和F油B 染色體基因的5'序列同源的40個(gè)堿基的反向寡核巧酸（3'CDXPhoR)(SEQIDN0:10)。 W下顯示了序列。預(yù)期的PCR產(chǎn)物長度為340個(gè)堿基對。
[0136] 5'CDX-PholF:AGTATAGGAACTTCGAAGCAGCTCCAGCCTACAAATAAAAAT GCCAGCCGATCGGGCTGG(SEQIDNO：9)
[0137] 3'CDXPhoR:TCATTCAATACCTCTGTAAGTCGCACATAGAGTAAGTTTCTG GTGGCGCATTATACCAGC佛QIDNO:10)
[0138] PCR方案使用：
[0139] 模板(10ng/!j.l) Ijil 5x HF PHUSION嚴(yán)緩沖液 10川 lOmM dNTPs lj.il DM SO 2jil 正向寡板普酸1{j1反向寡枯普酸20|iM 1叫 PHUSION⑥聚合酶口U/燭 0.5jil 邱0 33.5!il 總體積 50|j1
[0140] 使用的PCR條件是98°C持續(xù)2分鐘，1個(gè)循環(huán)，之后是98°C持續(xù)10秒、60°C持續(xù) 15秒、W及72°C持續(xù)20秒鐘，30個(gè)循環(huán)，然后是72°C持續(xù)2分鐘的最終循環(huán)。
[0141] 在第二步驟中，使用W下引物從地D13質(zhì)粒PCR擴(kuò)增卡那霉素盒。正向寡核巧酸 巧'Kan巧（SEQIDNO: 11)包含與整合位點(diǎn)的上游序列同源的35個(gè)堿基并且反向寡核巧 酸（3'Kan時(shí)（SEQIDNO: 12)包含與化〇1的5'序列同源的35個(gè)堿基。預(yù)期的PCR產(chǎn)物 的長度為1380個(gè)堿基對。
[0142] 5,KanF:AGGCGGTGGCTCGATCTTAGCGATGTGTGTAAGGCTGCGCATTCC GGGGATCCGTCGACC(SEQIDNO： 11)
[0143] 3,KanR:AAAGGCAAAAATGCCAGCCCGATCGGCTGGCATTTTTATTTGTAG GCTGGAGCTGCTTCG(沈QIDNO: 12)
[0144] PCR方案使用：
[0145] 模板(10打g/|il) Ijil 5x HF腳肋熟ON?緩沖猿 10,Ltl lOmM dNTPs 叫 DM SO 2pl 立向寡核普酸2卽M Ijil
[0146] 反向寡接菩酸2〇,uM： 1川 PHUSION?聚合酶(2U/|_il) 0.5|il H2O 33.5j.ll 總體積 5(仙
[0147] 使用的PCR條件是98°C持續(xù)2分鐘，1個(gè)循環(huán)，之后是98°C持續(xù)10秒、60°C持續(xù) 15秒、和72°C持續(xù)20秒，30個(gè)循環(huán)，然后是72°C持續(xù)2分鐘的最終循環(huán)。
[0148] 在步驟3中，將來自之前兩個(gè)步驟的兩種PCR產(chǎn)物凝膠純化，并將其用作模板W在 拼接重疊和延長PCR(SOE)中使用W下寡核巧酸組裝最終的整合盒。最終的盒長度是1650 個(gè)堿基對。
[0149] 5,KanF:AGGCGGTGGCTCGATCTTAGCGATGTGTGTAAGGCTGCGCATTCC GGGGATCCGTCGACC(SEQIDNO:11)
[0150] 3'CDXPhoR:TCATTCAATACCTCTGTAAGTCGCACATAGAGTAAGTTTCTG GTGGCGCATTATACCAGC佛QIDNO: 10)
[0151]PCR方案使用：
[0152] 模板(每種PCR產(chǎn)物1 Ong) \ix\ 5x HF PHUSION處緩沖液 lOjil lOmM dNTPs Ijil DMSO 2jii 正向寡杖普酸2〇|iM ljj,i 反向寡板菩酸2()|iM l)ii PHUSION飯聚合酶aU4il) a5jil H，0 33 5|il 總體積 50|il
[0153] 所使用的PCR條件是98°C持續(xù)2分鐘，1個(gè)循環(huán)，之后是98°C持續(xù)10秒、65°C持續(xù) 15秒、和72°C持續(xù)1分鐘，30個(gè)循環(huán)，然后是72°C持續(xù)2分鐘的最終循環(huán)。在該反應(yīng)之后， 純化PCR產(chǎn)物并通過PCR純化柱（Qiagen)脫鹽并用水洗脫。
[0154]W下顯示了最終的盒的DNA序列。W粗體顯示與染色體同源的區(qū)域：
[0156] 實(shí)施例3
[0157] 構(gòu)建具有在化〇1啟動(dòng)子的控制下的化bB的菌株
[015引該實(shí)例描述了具有在化01啟動(dòng)子的控制下的fabB的大腸桿菌菌株的構(gòu)建。在該 構(gòu)建體中，如W下描述的，將實(shí)施例2中描述的盒用于替換大腸桿菌菌株W3110K(CGSC)的 染色體中的F油B基因的原始調(diào)控區(qū)。
[0159] 首先，制備重組酶誘導(dǎo)的細(xì)胞。使用包含質(zhì)粒PSIM5的菌株W3110K的單克?。▍?見，0曰的曰等人，66116 379:109-115巧006])接種311111^8培養(yǎng)基值1'(3〇)+30^邑/1111^氯霉素 并在30°C下過夜培養(yǎng)。將350yL該過夜培養(yǎng)物添加到250ml帶有擋板的化affled)錐形 燒瓶中的40mLTB培養(yǎng)基值ifco)+30yg/mL氯霉素（被預(yù)熱到30°C)。在30°C下伴隨W 250巧m的搖動(dòng)使細(xì)胞生長持續(xù)2小時(shí)45分鐘（~0. 5的0D600)。將燒瓶立即轉(zhuǎn)移到42°C 水浴，并伴隨W3(K)巧m的搖動(dòng)解育持續(xù)12分鐘（該步驟確保重組酶已被誘導(dǎo)）。緊接著 誘導(dǎo)，使培養(yǎng)物在冰水中迅速冷卻并留在冰上持續(xù)5-10分鐘。經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到預(yù) 冷卻的離屯、管中并在4°C、~4000Xg下離屯、持續(xù)lOmin。吸去上清液并將1ml冰冷的無菌 蒸饋&0添加到細(xì)胞團(tuán)W重懸細(xì)胞，在重懸之后，添加另外的40ml冰冷的蒸饋&0。如在之 前的步驟中的，再次離屯、離屯、管（即，在4°C、~4000Xg下lOmin)。輕輕倒出得到的40ml 上清液并在1ml冰冷的蒸饋&0中重懸細(xì)胞團(tuán)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷卻的微量離屯、管中并在 4°C冷卻的微型離屯、機(jī)中W~l〇,〇〇〇xg離屯、持續(xù)Imin。吸去上清液并再一次重復(fù)洗涂步 驟。在~250y1無菌冰冷的蒸饋&0中重懸得到的細(xì)胞團(tuán)并保持在冰上，直到使用。
[0160] 然后，通過將1y1到10y1 (~10化g)無鹽PCR片段用移液管移入至在步驟1中 制備的50 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞來進(jìn)行線性PCR產(chǎn)物到重組酶誘導(dǎo)的細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化。將細(xì) 胞和DNA混合物轉(zhuǎn)移到在冰上的1mm比色杯并在1. 7kV下電穿孔。緊接著電轉(zhuǎn)化，在新的 無菌離屯、管中將細(xì)胞在2血SOC培養(yǎng)基（Invitrogen)中重懸。然后，將離屯、管在37°C下解 育持續(xù)~3小時(shí)，W允許完成藥物耐受基因的重組和表達(dá)。
[0161] 解育之后，針對陽性整合體選擇細(xì)胞。在該過程中，將W上描述的~3小時(shí)的解育 之后得到的100y1培養(yǎng)物接種到具有20yg/血卡那霉素的瓊脂平板上。另外，使ImL細(xì)胞 停止旋轉(zhuǎn)，在100y1LB中重懸并接種到具有40yg/mL卡那霉素的LA值ifco)平板上。在 37°C下過夜解育平板。觀察到每100y1培養(yǎng)物約~20個(gè)克隆。
[0162] 解育之后，進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕蚪M修飾的證實(shí)。在該步驟中，將來自上述平板的克隆劃 線接種至非選擇LB平板上，W產(chǎn)生單克隆。通過PCR和測序來驗(yàn)證來自非選擇平板的十二 (12)個(gè)克隆。兩個(gè)合成寡核巧酸被用于擴(kuò)增fab調(diào)控區(qū)（如W下顯示的，F(xiàn)B基因組-上和 FB基因組-下）。運(yùn)些寡核巧酸為位于染色體中的改變的區(qū)域的上游或下游的約250個(gè)堿 基。該P(yáng)CR產(chǎn)物的預(yù)期大小是3227bp。
[016引 FB基因組-上：TTGGAAAAATAGACATCGTCAAAATCTC(沈QIDN0:14)
[0164]FB基因組-下：TGCAGCGCAAGGCGAGGAGTATCCCCGTCT(沈QIDN0:15)
[0165] PCR方案使用：
[0166] 模板(溶于成0中的克隆） 1燦 5x HE民CULA化嚴(yán)II反應(yīng)緩沖液 10川 IQmMdNTPs Ijil 甜萊堿5M lOjil 正向寡板菩酸20^lM 1如 反向寡枯普聽絨jiM: 1|4 HE民CULASE底II Fusion DNA 聚合0 5)^1 酶(2U/|il) H，0 25.5'lU 總體積 50|j1
[0167] 所使用的PCR條件是95°C持續(xù)2分鐘，1個(gè)循環(huán)，之后是95°C持續(xù)20秒、60°C持續(xù) 30秒、和72°C持續(xù)3分鐘，30個(gè)循環(huán)，然后是72°C持續(xù)2分鐘的最終循環(huán)。
[016引利用W下引物對獲得的PCR產(chǎn)物充分測序：
[0169]
[0170] 實(shí)施例4
[0171] 通過qPCR分析F油BmRNA
[0172] 在該實(shí)施例中，描述了利用qPCR進(jìn)行W量化在實(shí)施例3中產(chǎn)生的菌株產(chǎn)生的化bB mRNA的水平的實(shí)驗(yàn)。在運(yùn)些實(shí)驗(yàn)中，材料包括RNeasyMini試劑盒（Qiagen)、RNAprotect BacterialReagent(Qiagen)、琉基乙醇、乙醇、溶菌酶（Sigma)、蛋白酶K(Qiagen)、無RNA 酶的DM酶集合（Qiagen)、
[0173]Zym〇-RNAcleanandconcentrator-S狂ymo)、ImProm-II逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Promega)、 Li曲t切cler480SYBRGreenMasterMix(Roche)和qPCR引物。
[0174] 在該方案中，通過將培養(yǎng)物的樣品直接地添加到具有2體積RNAprotect bacterialreagent的管中來制備RNA?；旌蟽?nèi)容物并在RT下解育持續(xù)5分鐘。通常，在~ 0. 5-0.8的誘導(dǎo)0D下，獲取約1-1. 5血的等份并在稍后的時(shí)間點(diǎn)取樣~0. 25-0. 4血。在 5000xg下對每個(gè)樣品離屯、持續(xù)lOmin并輕輕倒出上清液。運(yùn)時(shí)，在-80下冷凍或直接地用 于RNAMini試劑盒。
[0175] 首先，如RNeasy手冊的方案4中所指導(dǎo)的（細(xì)菌的酶促裂解和蛋白酶K消化） 制備RNA。利用Nano化op2000儀器（Thermo)定量RNA。接下來，通過溫和的混合將固 體粉末溶于550uL水中來制備DNA酶1存儲(chǔ)液并將其分成50uL等份，將50uL等份存儲(chǔ) 在-20°C，直到使用。DNA酶反應(yīng)使用《加gRNA、3uL畑D緩沖液、luLDNA酶1和足夠提供 30uL溶液的水。將溶液在37°C下解育持續(xù)30min。然后，添加另外的luLDNA酶并將溶液解 育又一 30min。添加另外的lulDNA酶并將溶液解育持續(xù)1小時(shí)。按照制造商的指示，利用 Zymo-RNAcleanandconcentrator-S清潔反應(yīng)并且然后在20uL水中洗脫。利用Nano化op 2000儀器燈hermo)定量RNA并將終濃度調(diào)整到25ng/ul。
[0176] 接下來，利用Improm-II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒?(P;romega)合成cDNA，用于在qPCR中使 用。在該程序