焦磷酸測序法檢測aldh2基因分型的引物對及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外核酸檢測技術領域，尤其涉及一種焦磷酸測序法檢測乙醛脫氫酶 2(ALDH2)基因分型的引物對及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 人類乙醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase gene，ALDH)是一種四聯體蛋白，催化 乙醛和其他脂肪族醛氧化。目前，已發(fā)現ALDH有19種同工酶，主要有ALDHl~4四種，其 中ALDH2最為重要。在肝和胃中具有很高的表達量，是乙醇代謝途徑中最重要的酶之一。
[0003] ALDH2基因位于人類第12號染色體（12q24. 2)，它的主要多態(tài)性是rs671，即位于 外顯子12的G1510A。由于ALDH2基因存在G1510A多態(tài)性，導致氨基酸序列第487位上的谷 氨酸被賴氨酸所替換（即，Glu487Lys)，其中具有催化活性的野生型稱為G等位基因（即， ALDH2*1)，而催化能力失活的變異型稱為A等位基因（即，ALDH2*2)。統(tǒng)計表明，在亞洲的 黃種人群中，ALDH2*2是頻率最高且最重要的突變型。
[0004] 研究發(fā)現，突變型基因 ALDH2*2的存在能導致ALDH2活力的嚴重缺失，并與過度飲 酒導致的酒精依賴、酒精性中毒、酒精性肝病及消化道癌癥等疾病之間存在深刻的聯系。
[0005] -、ALDH2與酒精性疾病的關系：
[0006] 乙醛脫氫酶（ALDH)和乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH)在人體內共同 組成了人體乙醇脫氫酶系，負責催化人體的乙醇分解代謝。ALDH2在肝和胃中具有很高的表 達量，是乙醇代謝途徑中最重要的酶之一。
[0007] 肝中的乙醇脫氫酶負責將乙醇（酒的成分）氧化為乙醛，生成的乙醛作為底物進 一步在乙醛脫氫酶催化下轉變?yōu)闊o害的乙酸（醋的成分）。乙醛毒性高于乙醇，是造成宿醉 的主要原因之一。而且乙醛被懷疑具有致癌性，它與人類腫瘤的發(fā)生存在一定的關系。負 責人體內乙醛轉化的主要是肝中的乙醛脫氫酶（ALDH)。
[0008] 因此，過度的飲酒行為，不僅使ALDH2*2攜帶者對酒精產生依賴，還可能引起肝癌 等的酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease, ALD)。酒精性肝病是長期、大量飲酒所引起的 肝臟病變，已成為現代社會的主要健康隱憂之一。研究顯示，攜帶ALDH2變異基因型者大 量飲酒將顯著增加罹患肝癌的危險性。
[0009] 二、ALDH2與硝酸甘油治療的關系：
[0010] 硝酸甘油是治療心絞痛的經典藥物，研究發(fā)現硝酸甘油的舒血管作用是通過釋放 一氧化氮（NO)所介導。但臨床上部分病人舌下含服硝酸甘油不僅不能迅速有效地緩解心 絞痛，反而使心肌缺血加重。近來發(fā)現，ALDH2與硝酸甘油轉化為NO密切相關。有研究表 明，ALDH2*1基因型的患者硝酸甘油治療心絞痛的療效明顯優(yōu)于ALDH2*2患者，且前者迅速 起效率也明顯尚于后者。
[0011] 三、ALDH2與其他疾病的關系：
[0012] 雖然攝入人體的乙醇有90 %以上是在肝臟內完成代謝過程的，但其在攝入過程中 與消化道上皮細胞的直接接觸也不容忽視。在飲酒人群中，尤其是重度飲酒者，由于其上消 化道長期地與大量酒精直接接觸，該區(qū)域出現癌變（如食道癌、口咽癌等）的幾率明顯提 高。研究發(fā)現，ALDH2*2突變與飲酒人群患消化道癌的風險之間具有顯著的相關性。此外， ALDH2*2突變與胃癌的易感性也存在一定的相關性。由此可見，ALDH2*2突變是增加區(qū)域性 癌化幾率的重要因素之一。
[0013] 綜上所述，對患者進行ALDH2基因分型檢測，具有顯著的臨床意義：
[0014] 通過檢測ALDH2基因分型，了解其對藥物代謝速率快與慢的狀況，可以適時合理 調整相關藥物用藥劑量，提高疾病療效及降低治療過程中的毒副反應發(fā)生概率；
[0015] 通過檢測ALDH2基因分型，指導臨床治療過程中正確使用硝酸甘油，減少用藥無 效情況；
[0016] 通過檢測ALDH2基因分型，揭示個體酒精代謝能力的差異，從而防止個體過量飲 酒、降低酒精性中毒以及肝臟癌病的幾率；
[0017] 通過檢測ALDH2基因分型，揭示重大疾病的高危傾向，如ALDH2基因與食道癌、口 咽癌、胃癌、冠心病及心肌梗死等風險的相關性；檢測結果將對指導患者的日常生活大有助 益，也將有助于醫(yī)生給與其指導意見，對相關疾病預防和惡化的臨床干預具有重大意義。
[0018] 焦磷酸測序（Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序（即，確定DNA 中核苷酸的順序）方法，屬于新一代DNA序列分析技術，具備同時對大量樣品進行測序分 析的能力，并具有高通量、特異性高、快速、直觀及低成本的優(yōu)點。其基本原理為，由4種酶 催化的同一反應體系中的酶級聯化學發(fā)光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若 該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團 (PPi)，PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值，每個峰值的高度 與反應中摻入的核苷酸數目成正比；然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成；最后通過分 析出峰值的情況，達到測定DNA序列的目的。不過，現有技術中還沒有利用焦磷酸測序技術 檢測ALDH2基因分型的產品。
[0019] 目前，現有技術中，主要采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性 (PCR-RFLP)、手工或自動測序及序列特異性引物PCR等方法檢測ALDH2基因分型，這些方法 存在檢測結果準確性不高、檢測周期長及操作繁瑣的缺點，難以滿足臨床檢驗的標準要求。

【發(fā)明內容】

[0020] 為了解決上述方法檢測ALDH2基因分型過程中存在檢測結果準確性不高、檢測周 期長、操作繁瑣及難以滿足臨床檢驗要求的技術問題，本發(fā)明提供一種檢測結果準確、特異 性高、檢測周期短、操作簡單并有效滿足臨床檢驗要求的焦磷酸測序法檢測ALDH2基因分 型的引物對及試劑盒。
[0021] 本發(fā)明提供了一種焦磷酸測序法檢測ALDH2基因分型的引物對，所述ALDH2基因 檢測的多態(tài)性位點為ALDH2*2,所述引物對包括：
[0022] 正向擴增引物：5' -TCACCCTTTGGTGGCTACA-3'（SEQ ID NO. 1);
[0023] 反向擴增引物：5'-CCCCAACAGACCCCAATC-3'（SEQ ID NO. 2);
[0024] 測序引物：5'-CACACTCACAGTTTTCACTT-3'（SEQ ID NO. 3);
[0025] 其中，所述正向擴增引物的5'端進行生物素標記。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種焦磷酸測序法檢測ALDH2基因分型的試劑盒，所述ALDH2基 因檢測的多態(tài)性位點為ALDH2*2,所述試劑盒包括：
[0027] 正向擴增引物：5' -TCACCCTTTGGTGGCTACA-3'（SEQ ID NO. 1);
[0028] PCR反應液，所述PCR反應液含有反向擴增引物：5'-CCCCAACAGACCCCAATC-3'（SEQ ID NO. 2)；
[0029] 測序引物：5'-CACACTCACAGTTTTCACTT-3'（SEQ ID NO. 3);
[0030] 其中，所述正向擴增引物的5'端進行生物素標記。
[0031] 在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實施例中，所述試劑盒還包括：
[0032] ALDH2*2陽性對照品1，其為插有SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列的ALDH2*2野生純 合子質粒；
[0033] ALDH2*2陽性對照品2,其為所述ALDH2*2野生純合子質粒與插有SEQ ID NO. 6所 示核苷酸序列的ALDH2*2突變純合子質粒組成的質粒混合物；
[0034] ALDH2*2陽性對照品3,其為插有SEQ ID NO. 6所示核苷酸序列的ALDH2*2突變純 合子質粒；
[0035] 其中，質粒載體為PMD18-T質粒；所述ALDH2*2陽性對照品2中所述ALDH2*2突變 純合子質粒和所述ALDH2*2野生純合子質粒的數量比為1:1。
[0036] 在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實施例中，所述試劑盒還包括：質控品 (controloligo)和空白對照品，所述質控品的序列為：TAYGGTTTGCA(SEQIDNα4) ;所 述空白對照品為水；質控品的序列是由QIAGEN設計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測 PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。
[0037] 所述PCR反應液還含有其他組份，分別為常規(guī)的10 X PCR Buffer、dNTPS和H2O,各 組分按常規(guī)體積比配置（10XPCR Buffer、dNTPs、H20及PCR反應液中反向擴增引物的體積 比為 5 :3 :37. 5 :1)。
[0038] 所述試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑，如由DNA聚 合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，由5' -磷酰硫酸和熒光 素組成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。
[0039] 本發(fā)明還提供了如上所述的引物對在制備用于檢測乙醛脫氫酶2基因分型的試 劑中的應用。
[0040] 本發(fā)明還提供了如上所述的試劑盒在制備用于檢測乙醛脫氫酶2基因分型的試 劑中的應用。
[0041] 相較于現有技術，本發(fā)明提供的焦磷酸測序法檢測ALDH2基因分型的引物對及試