基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的乙型肝炎病毒（hbv）耐藥性基因檢測(cè)技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的乙型肝炎病毒(HBV)耐藥性基因檢測(cè)技術(shù)。具 體而言，本發(fā)明涉及用于基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基因突變的測(cè) 序引物。本發(fā)明還涉及包含測(cè)序引物的用于基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV) 耐藥基因突變的試劑盒和微陣列。本發(fā)明還涉及測(cè)序引物在制備用于基于焦磷酸測(cè)序技術(shù) 檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基因突變的試劑盒和微陣列中的用途。本發(fā)明還涉及使用測(cè) 序引物檢測(cè)樣品中的乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基因突變的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒(HBV)感染已成為全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害著人類的健 康。全球約有20億HBV感染者，其中約有4億將發(fā)展為乙肝，全球每年約有60萬(wàn)人死于與HBV 感染相關(guān)的疾病。目前，廣泛應(yīng)用的抗HBV藥物主要有兩類，即α2干擾素和核苷類藥物。核苷 類藥物中主要是拉米夫定和伐昔洛韋。拉米夫定是近年新發(fā)現(xiàn)的具有抗HBV作用的核苷類 藥物，適用于體內(nèi)HBV復(fù)制活躍且滴度較高的慢性乙型肝炎患者的治療，包括部分對(duì)干擾素 禁忌或干擾素治療無(wú)效的患者。但該類藥物需要長(zhǎng)期服用，且易產(chǎn)生耐藥，其中最主要的是 長(zhǎng)期服用該藥可引起編碼HBV DNA聚合酶的Ρ基因變異。
[0003] 臨床上HBV治療藥物耐藥研究： ①拉米夫定是目前應(yīng)用最廣、時(shí)間最長(zhǎng)的藥物，其主要的耐藥突變位點(diǎn)有rt204、 rtl80。耐藥的分子機(jī)制可能為rt204位點(diǎn)參與形成了拉米夫定與聚合酶的結(jié)合部位，rt204 突變后降低了拉米夫定與dNTP底物的親和力，降低突變株的復(fù)制力，從而降低拉米夫定的 抗病毒作用。其他突變位點(diǎn)有竹169、竹173、竹180、竹184等。
[0004] ⑤柯德福韋酯屬于無(wú)環(huán)嘌呤類核苷酸類似物。相關(guān)的耐藥突變多為多點(diǎn)突變，主 要耐藥位點(diǎn)有rtl81、rt236。
[0005] 恩替卡韋對(duì)初治患者很少發(fā)生耐藥，但在拉米夫定失效患者中耐藥發(fā)生率明顯 增加。恩替卡韋耐藥變異需要在rt204+rtl80位突變的基礎(chǔ)上，再聯(lián)合rtl84、rt202、rt250 和rtl69位點(diǎn)上一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變。
[0006] φ替比夫定與拉米夫定耐藥基因序列相似，但其耐藥發(fā)生率更低。耐藥突變位點(diǎn) 為rt204。
[0007] ⑤替諾福韋是一種新型核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，有報(bào)道稱其耐藥與rtl94變異 有關(guān)，能改變DNA與dNTP底物的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響DNA合成。
[0008] 現(xiàn)已有多種生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于HBV基因變異檢測(cè)，如聚合酶鏈反應(yīng)-逆向點(diǎn)雜 交、PCR-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性、基因芯片、限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性技術(shù)、實(shí)時(shí)PCR、PCR產(chǎn)物 直接測(cè)序等。
[0009] 聚合酶鏈反應(yīng)-逆向點(diǎn)雜交操作繁瑣，成本高。PCR-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析只 能分析已知序列特異位點(diǎn)的基因突變，且有些耐藥突變很難找到合適的限制性內(nèi)切酶，因 此檢測(cè)的突變類型有限。基因芯片樣本的制備和標(biāo)記較繁瑣，儀器昂貴，檢測(cè)成本高。限制 性片段質(zhì)譜多態(tài)性技術(shù)也只能分析已知序列且價(jià)格昂貴。實(shí)時(shí)PCR需要針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì) 探針，隨著耐藥位點(diǎn)增多，成本增高。同時(shí)一些非測(cè)序方式需要依賴酶切或聚類的方式判讀 患者的基因突變情況，存在較大的分型錯(cuò)誤的幾率。直接測(cè)序雖然準(zhǔn)確度高，但測(cè)序反應(yīng)產(chǎn) 生的DNA片段需要經(jīng)過毛細(xì)管電泳分離，其后由檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光信號(hào)，耗時(shí)較長(zhǎng)且檢測(cè)成 本較高。
[0010]焦磷酸測(cè)序法可對(duì)一定長(zhǎng)度內(nèi)序列進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，其重復(fù)性和精確性能與 Sanger測(cè)序媲美，而檢測(cè)速度大大提高，檢測(cè)成本明顯降低。此外，焦磷酸測(cè)序技術(shù)的檢測(cè) 靈敏度也遠(yuǎn)高于Sanger測(cè)序。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于微生物鑒定及分法醫(yī)學(xué)鑒、遺傳學(xué) 分析、SNP檢測(cè)等方面。因此，焦磷酸測(cè)序技術(shù)在HBV基因變異檢測(cè)的應(yīng)用與推廣將具有極大 價(jià)值與潛力。
[0011]然而，目前尚沒有商業(yè)化實(shí)現(xiàn)焦磷酸測(cè)序技術(shù)在乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基因突 變檢測(cè)的方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明一方面涉及用于基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基因突 變的測(cè)序引物，所述測(cè)序引物包含至少一個(gè)選自以下的核苷酸序列：SEQ ID N0: 3、7、11、 17、21和25以及它們的任意組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)序引物具有至少一個(gè)選自以下 的核苷酸序列，或者由或基本由至少一個(gè)選自以下的核苷酸序列組成：SEQ ID N0: 3、7、 11、17、21和25以及它們的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)序引物針對(duì)的靶標(biāo)序列 為選自以下的序列：SEQ ID N0: 6、10、14、20、24和28以及它們的任意組合。
[0013] 本發(fā)明一方面涉及用于基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基因突 變的測(cè)序引物組，所述測(cè)序引物組包括： 包含或具有選自SEQ ID N0: 3、7、11、17、21和25之一的核苷酸序列的測(cè)序引物，和 包含或具有選自SEQ ID N0: 3、7、11、17、21和25的另外一個(gè)、另外兩個(gè)、另外三個(gè)、另 外四個(gè)或全部另外五個(gè)的核苷酸序列的測(cè)序引物。
[0014] 本發(fā)明另一方面涉及一種用于基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)耐藥 基因突變的試劑盒或微陣列，其包含本發(fā)明的測(cè)序引物或測(cè)序引物組。本發(fā)明另一方面涉 及本發(fā)明的測(cè)序引物或測(cè)序引物組在制備用于基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)樣品中的乙型肝 炎病毒(HBV)耐藥基因突變的試劑盒或微陣列中的用途。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒或微陣列還包含至少一種選自以下的引物組： 1) 引物組1，其包含具有由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的引物;和 2) 引物組2,其包含具有由SEQ ID N0: 15所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列的引物。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒或微陣列還包含表明至少一種選自以下的待分析 序列和分配順序的說明書： 1)由SEQ ID N0: 4所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 5所示的分配順序； 2) 由SEQ ID NO: 8所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 9所示的分配順序； 3) 由SEQ ID NO: 12所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 13所示的分配順序； 4) 由SEQ ID NO: 18所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 19所示的分配順序； 5) 由SEQ ID NO: 22所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 23所示的分配順序;和 6) 由SEQ ID NO: 26所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 27所示的分配順序。
[0017] 本發(fā)明還涉及一種基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)樣品中的乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基 因突變的方法，所述方法包括： (1) 提取和任選純化樣品中的DNA， (2) 將提取和任選純化的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物， (3) 對(duì)步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述焦磷酸測(cè)序使用本發(fā)明的測(cè)序引物或測(cè)序引物組進(jìn)行。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增為PCR擴(kuò)增，優(yōu)選所述PCR擴(kuò)增使用本發(fā)明的引物組。在又一 個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)樣品中的乙型肝炎病毒(HBV)耐藥基因突變的方法可不用于診斷受試 者的耐藥性，例如可用于檢測(cè)體外培養(yǎng)中的乙型肝炎病毒是否變異，可用于檢測(cè)環(huán)境來(lái)源 的乙型肝炎病毒樣品是否具有耐藥性。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述焦磷酸測(cè)序還使用至少一種選自以下的待分析序列和分 配順序： 1) 由SEQ ID N0: 4所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 5所示的分配順序； 2) 由SEQ ID N0: 8所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 9所示的分配順序； 3) 由SEQ ID N0: 12所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 13所示的分配順序； 4) 由SEQ ID N0: 18所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 19所示的分配順序； 5) 由SEQ ID N0: 22所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 23所示的分配順序;和 6) 由SEQ ID N0: 26所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 27所示的分配順序。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品為生物樣品，優(yōu)選所述樣品為體液樣品或組織樣品， 和更優(yōu)選所述樣品選自活組織檢查樣品、細(xì)胞培養(yǎng)物、經(jīng)固化處理的樣品（如石蠟包埋樣 品）、全血、血漿、血清、唾液、腦髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、糞便、分泌液、乳汁、腹膜 液。
【附圖說明】