EP蛋白W及人PAEP蛋白的部 分膚。所述PAEP蛋白的部分膚含有與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的功能域。
[0031] "PAEP蛋白"包括人PAEP蛋白化及人PAEP蛋白的任何功能等同物。所述功能等 同物包括人PAEP蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天 然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊條件下能與人PAEP的DNA雜交的DNA所編碼的蛋 白質(zhì)。
[0032] 優(yōu)選地，PAEP蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0033] (1)由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0034] 似將SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO. 2所示 的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數(shù)通常為1-50個，較佳地 1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。
[0035] (3)與SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性（又稱為序列同一 性），更優(yōu)選地，與SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、 97 %、98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[0036] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述PAEP蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0037] 通常，已知的是，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0038] 通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是PAEP蛋白的融合 蛋白。對于與PAEP蛋白融合的膚或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留PAEP蛋 白的生物學(xué)活性即可。
[0039] 本發(fā)明的PAEP蛋白也包括對SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留PAEP蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變 的氨基酸數(shù)目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。
[0040] 在本發(fā)明的上下文中，"診斷骨關(guān)節(jié)炎"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有骨關(guān)節(jié) 炎、也包括判斷受試者是否存在患有骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險。
[0041] 在本發(fā)明的上下文中治療骨關(guān)節(jié)炎"從疾病的狀態(tài)變化來分，可W包括疾病的 緩解、疾病的完全治愈。
[0042] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0043] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了PAEP基因表達與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)，通過檢測受試者滑膜組織中 PAEP的表達，可W判斷受試者是否患有骨關(guān)節(jié)炎、或者判斷受試者是否存在患有骨關(guān)節(jié)炎 的風(fēng)險，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。 W44] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標記物-PAEP基因，相比傳統(tǒng)的檢測手段，基因診斷 更及時、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷，從而降低骨關(guān)節(jié)炎的死亡率。
【附圖說明】
[0045] 圖1顯示利用QPCR檢測PAEP基因在滑膜細胞中的表達情況；
[0046] 圖2顯示利用Western blot檢測PAEP蛋白在滑膜細胞中的表達情況；
[0047] 圖3顯示利用QPCR檢測PAEP基因的轉(zhuǎn)錄情況； W48] 圖4顯示利用Western blot檢測PAEP蛋白的過表達情況； W例圖5顯示滑膜液對OA成纖維樣滑膜細胞的增殖作用；
[0050] 圖6顯示PAEP基因過表達對刺激條件下的OA成纖維樣滑膜細胞增殖的抑制作 用；
[0051] 圖7顯示PAEP基因過表達對OA成纖維樣滑膜細胞增殖的抑制作用。
[0052] 具體的實施方式
[0053] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。W下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew化rk:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0054] 實施例1 OA滑膜組織和正常滑膜組織中PAEP基因的表達差異 陽化5] 60例OA患者的滑膜組織來自于北京協(xié)和醫(yī)院骨科行膝關(guān)節(jié)置換或滑膜切除術(shù)的 OA病人。所用病例符合Altam提出的關(guān)于OA的診斷標準。40例正?；そM織來自于北京協(xié) 和醫(yī)院骨科，為外傷手術(shù)病人關(guān)節(jié)滑膜組織。OA患者滑膜液（S巧高速離屯、后取上清，-80°C 儲存待用。本研究中所用臨床樣本，均對患者進行知情告知并經(jīng)本院倫理委員會通過。
[0056] UPAEP基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測
[0057] 1. 1滑膜組織細胞體外培養(yǎng)
[0058] 將無菌獲取的滑膜組織用PBS清洗后，用無菌手術(shù)剪刀反復(fù)剪切成約ImmXlmmX Imm的組織塊，加入膠原酶II(0. 5mg/ml)37°C、消化化后，經(jīng)200目紗網(wǎng)過濾，離屯、去上清 后，將細胞重懸于DMEM培養(yǎng)液，置于37°C，5 %C〇2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當細胞長成梭形并 成片后，進行傳代培養(yǎng)。當細胞傳至第3代后，分別加入FITC標記的小鼠抗人CD3、CD14、 CD19和PE標記的小鼠抗人CDl化進行標記，流式細胞儀檢測鑒定。上述4種標記均為陰性 的細胞為成纖維樣滑膜細胞（Fibroblast-likeSynovio巧tesJL巧用于本研究。
[0059] 1. 2 總RNA提取 W60] 利用QIAGEN公司的組織/細胞總RNA提取試劑盒提取OA患者滑膜組織細胞和正 ?；そM織細胞的總RNA。
[0061] 1.3逆轉(zhuǎn)錄
[0062] 利用TAKARA公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA的逆轉(zhuǎn)錄。
[0063] 1. 4QPCR W64] (1)引物設(shè)計 陽0化]根據(jù)Genbank中PAEP基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計QPCR擴增引物，由上海 生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列如下：
[0066] PAEP基因：
[0067]正向引物為 5'-GCTGTGTTGAGAAGAAGGT-3'（沈QIDNO. 3);
[0068]反向引物為5' -TTCGCCACCGTATAGTTG-3'（沈Q ID NO. 4)，
[0069] GAP畑基因：
[0070]正向引物為 5' -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（沈QIDNO.5);
[0071] 反向引物為 5, -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQIDNO. 6)。 陽0巧 似按照表1配制PCR反應(yīng)體系：
[0073] 其中，SYBRGreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系購自Invitrogen公司。
[0074] 表1PCR反應(yīng)體系 陽0巧]

[0076] (3)口〇?反應(yīng)條件：95°(：10111111，（95°(：153,601：603)*46個循環(huán)。^5￥81?6的611 作為巧光標記物，在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和 電泳確定目的條帶，AACT法進行相對定量。
[0077] 1. 5統(tǒng)計學(xué)方法
[0078] 實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值+標準差的方式來表 示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0. 05 時具有統(tǒng)計學(xué)意義。 陽0巧]1. 6結(jié)果
[0080] 結(jié)果如圖1所示，與正?；そM織相比，骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織細胞中PAEP基因表達 量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<〇. 05)。
[0081] 2、PAEP基因表達--蛋白水平的檢測 陽0間 2. 1步驟：使用常規(guī)的westernblot進行PAEP蛋白水平的檢測。 陽〇8引 2. 2統(tǒng)計學(xué)處理
[0084] 將蛋白條帶的灰度值使用ImageJ軟件進行分析，W0 -actin為內(nèi)參，將PAEP蛋 白條帶的灰度值進行歸一化處理。實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均 值+標準差的方式來表示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采 用t檢驗，