Paep基因及其表達(dá)產(chǎn)物作為骨關(guān)節(jié)炎的診治靶標(biāo)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及人PAEP基因在骨關(guān)節(jié)炎的診斷、治療中的 用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨關(guān)節(jié)炎（Osterart虹itis，OA)是一組由多種原因?qū)е碌腤關(guān)節(jié)軟骨退行性變 為主要病理特征的臨床綜合征，是一種常見病，多發(fā)生于中年W后，是一種慢性、進(jìn)展性關(guān) 節(jié)病變。主要發(fā)生在關(guān)節(jié)軟骨。其表現(xiàn)主要是關(guān)節(jié)軟骨受到破壞，軟骨表面失去均質(zhì)性、中 斷、斑片凹陷、斷裂和潰瘍。近來一些研究表明骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與遺傳因素有關(guān)。滑膜對于 維持關(guān)節(jié)的正常功能，并且在骨關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。
[0003]目前臨床上對于骨關(guān)節(jié)炎的診斷主要基于影像學(xué)的檢查。X線表現(xiàn)主要為關(guān)節(jié)間 隙狹窄，軟骨下骨質(zhì)硬化及囊性變，關(guān)節(jié)邊緣骨寶形成，關(guān)節(jié)面萎陷、變形和關(guān)節(jié)半脫位等。 MRI可示早期軟骨、半月板等關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病變，有利于早期診斷。CT用于椎間盤病的診斷， 優(yōu)于X線。關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨硬化，邊緣性骨刺脊椎關(guān)節(jié)連成骨橋。亦可見骨囊腫W 及崎形。如發(fā)現(xiàn)運些變化可作為診斷的依據(jù)和估計關(guān)節(jié)損傷的程度。OA-般在早期沒有或 很少有癥狀，只在繼發(fā)炎癥、疼痛或影響關(guān)節(jié)的活動時，病人才找醫(yī)生。此時，關(guān)節(jié)損傷發(fā)生 已久。因為開發(fā)用于早期骨關(guān)節(jié)炎診斷的方法是亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于骨關(guān)節(jié)炎 (Osterart虹itis，OA)早期診斷的分子標(biāo)志物。相比傳統(tǒng)的骨關(guān)節(jié)炎的診斷方法，使用基 因標(biāo)志物來診斷骨關(guān)節(jié)炎的具有及時性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知 曉疾病風(fēng)險，針對風(fēng)險高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。 陽〇化]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種人PAEP基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品中的應(yīng) 用。
[0007] 進(jìn)一步，上面所提到的診斷產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位 雜交或忍片檢測PAEP基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平W診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品。
[0008] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PA邸基因的 引物；所述用實時定量PCR診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PAEP基因的引物； 所述用免疫檢測診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：與PAEP蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜 交診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：與PAEP基因的核酸序列雜交的探針；所述用忍片診斷骨關(guān)節(jié) 炎的產(chǎn)品包括：蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括與PAEP蛋白特異性結(jié)合的抗體， 基因忍片包括與PAEP基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 優(yōu)選地，所述產(chǎn)品包括忍片、試劑盒。
[0010] 本發(fā)明還提供了人PAEP基因在高通量測序平臺中的應(yīng)用。隨著高通量測序技術(shù) 的發(fā)展，對一個人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常 人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知人 PAEP基因的異常與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)也屬于人PAEP基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之 內(nèi)。
[0011] 本發(fā)明還提供了人PAEP基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng) 用。
[0012] 進(jìn)一步，所述藥物包括：含有人PAEP基因的藥物、攜帶人PAEP基因的載體或宿主 細(xì)胞所形成的藥物、人PAEP蛋白質(zhì)藥物、或其他能夠促進(jìn)PAEP基因表達(dá)的藥物。本發(fā)明的 藥物可W用于補充內(nèi)源性的人PAEP蛋白的缺失或不足，通過提高人PAEP蛋白的表達(dá)，從而 治療因人PAEP蛋白缺乏導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎。
[0013] 本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、 粘粒、隧菌體、病毒等。
[0014] 在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物 細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
[0015] 進(jìn)一步，本發(fā)明的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，載體，運類載體包括（但并不 限于）：稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、薦糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明 膠和聚乙締化咯燒酬；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸巧和碳酸氨鋼；吸收促進(jìn)劑季錠 化合物；表面活性劑如十六燒醇；吸附載體如高嶺±和皂粘± ;潤滑劑如滑石粉、硬脂酸巧 和儀、聚乙二醇等。
[0016] 本發(fā)明的藥物導(dǎo)入組織或者細(xì)胞的方式可W分為體外或者體內(nèi)的方式。體外方式 包括將含有人PAEP基因的藥物或者含有人PAEP蛋白質(zhì)的藥物導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植 或回輸?shù)襟w內(nèi)。體內(nèi)方式包括直接將含有人PAEP基因的藥物或者含有人PAEP蛋白質(zhì)的藥 物注入體內(nèi)組織中。
[0017]本發(fā)明的藥物還可與其他治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可W大大 提到治療的成功率。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的忍片，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍片； 所述基因忍片包括固相載體W及固定在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括 用于檢測PAEP基因轉(zhuǎn)錄水平的針對PAEP基因的寡核巧酸探針；所述蛋白質(zhì)忍片包括固相 載體W及固定在固相載體的PAEP蛋白的特異性抗體。
[0019] 進(jìn)一步，所述基因忍片可用于檢測包括人PAEP基因在內(nèi)的多個基因（例如，與骨 關(guān)節(jié)炎相關(guān)的多個基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測包括人PAEP蛋白在內(nèi) 的多個蛋白質(zhì)（例如與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個與骨關(guān)節(jié)炎 的標(biāo)志物同時檢測，可大大提高骨關(guān)節(jié)炎診斷的準(zhǔn)確率。
[0020] 本發(fā)明提供了一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的試劑盒，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋 白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測PAEP基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋 白免疫檢測試劑盒包括PAEP蛋白的特異性抗體。
[0021] 進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或忍片方 法檢測PAEP基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對PAEP基因的引 物和/或探針。根據(jù)PAEP基因的核巧酸序列容易設(shè)計出可W用于檢測PAEP基因表達(dá)水平 的引物和探針。
[0022] 與PAEP基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結(jié)合， 任何長度都可W。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針 的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度 對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一 般不超過30個堿基對，與目的核巧酸序列互補的長度W15-25個堿基對最佳。所述探針自 身互補序列最好少于4個堿基對，W免影響雜交效率。
[0023] 進(jìn)一步，所述PAEP蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述PAEP 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab')2、Fv等。只要所述片段能夠保留與PAEP蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì) 水平的抗體的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可W使用任何方法來制備所述抗 體。
[0024] 在本發(fā)明的上下文中/'PAEP基因"包括人PAEP基因W及人PAEP基因的任何功能 等同物的多核巧酸。PAEP基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中PAEP基因 (NC_000009. 12)DNA序列具有70%W上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列； 陽0巧]優(yōu)選地，PAEP基因的編碼序列包括W下任一一種DNA分子：
[0026] (1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA序列；
[0027] 似在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列； 陽02引 做與（1)或似限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90%W上同源性，且編碼相 同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0029] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述PAEP基因的編碼序列是SEQIDNO. 1所示的 DNA序列。
[0030] 在本發(fā)明的上下文中，PAEP基因表達(dá)產(chǎn)物包括人PA