專利名稱：α－半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼用α-半乳糖苷酶的方法。
背景技術(shù)：
α-半乳糖苷酶是一種以特異性水解半乳糖類寡糖和多聚半乳-(葡)甘露聚糖的非還原性末端α-1，6-半乳糖苷鍵為特征的寡糖水解酶，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。由于α-半乳糖苷酶能水解豆類中蜜二糖、棉籽糖、水蘇糖和毛蕊花糖等低聚糖和半乳甘露聚糖的多糖，能起到改善糖代謝等作用，因此主要用于飼料和食品等工業(yè)之中。
目前，飼料工業(yè)隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)區(qū)域化、規(guī)?；暳媳戎氐奶岣叨蟀l(fā)展，我國(guó)飼料資源緊缺的矛盾日益突出；據(jù)專家預(yù)測(cè)，2010年-2020年，我國(guó)蛋白質(zhì)飼料的差額為2400萬(wàn)噸-4800萬(wàn)噸。豆粕因含有43％～48％的粗蛋白、并有較平衡的氨基酸組成，而成為畜禽最重要的植物性蛋白源；然而美中不足的是豆類所含的低聚糖如蜜二糖、棉籽糖、水蘇糖和少量的毛蕊花糖不能被單胃動(dòng)物消化吸收，卻被腸道微生物發(fā)酵，產(chǎn)生二氧化碳、甲烷和氫氣等氣體，引起脹氣，導(dǎo)致能量損失，增加食糜的通行速度，降低養(yǎng)分吸收，極大地影響了豆粕的飼用價(jià)值，并導(dǎo)致養(yǎng)殖成本的增加和環(huán)境污染。
資料表明大豆粕中棉籽糖和水蘇糖含量約為1.4％和5.2％，為了消除這些不溶性低聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，長(zhǎng)期以來(lái)一直采用高溫、高壓、高濕和延長(zhǎng)時(shí)間等方法壓榨大豆，或者采用有機(jī)溶劑萃取法消除這些抗?fàn)I養(yǎng)因子，即使采取最適宜的加工工藝處理大豆，豆粕中仍然存在一定量的α-半乳糖苷，而且也增加了豆粕的生產(chǎn)成本。
經(jīng)研究與實(shí)踐證明，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)的成果-酶制劑來(lái)提高雜粕在飼料中的使用量及利用率是目前降低飼料成本和減輕環(huán)境污染的有效方法之一，也順應(yīng)生態(tài)農(nóng)業(yè)的要求。我國(guó)α-半乳糖苷酶在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用還處于初步研究階段，尤其與其他酶制劑的配伍研究未見(jiàn)報(bào)道，由此可見(jiàn)，利用微生物發(fā)酵法工業(yè)化、規(guī)?；厣a(chǎn)α-半乳糖苷酶有著廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景。
目前也利用微生物生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的報(bào)道，但是現(xiàn)有的α-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶水平偏低，對(duì)產(chǎn)酶菌的發(fā)酵特性、營(yíng)養(yǎng)特性和發(fā)酵技術(shù)并未進(jìn)行系統(tǒng)的研究；因此探索酶活高，既可用液體種子也可用固體種子接種的α-半乳糖苷酶生產(chǎn)方法顯得很有必要。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種產(chǎn)酶活力高、工藝簡(jiǎn)單、易于生產(chǎn)應(yīng)用的α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過(guò)這樣的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的提供一種α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟1)、孢子懸液的制備將保藏號(hào)為CGMCC No.1628的臭曲霉接種到斜面培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)7天；再用無(wú)菌水制成濃度為106～107個(gè)/ml的孢子懸液，待用；所述斜面培養(yǎng)基為PDA斜面培養(yǎng)基；2)、一級(jí)種子制備首先將液體種子培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照體積比為5％的接種量將孢子懸液接入上述冷卻后的液體種子培養(yǎng)基中，于28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上培養(yǎng)18h，得液體種子；所述液體種子培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基；3)、α-半乳糖苷酶的發(fā)酵首先將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照1毫升/10克的接種量將上述液體種子接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，?8℃培養(yǎng)4～7天，在培養(yǎng)過(guò)程中，于20h時(shí)進(jìn)行混勻振蕩發(fā)酵培養(yǎng)基的步驟；所述發(fā)酵培養(yǎng)基由重量比為2∶3的干基和蒸餾水混和后、調(diào)pH至5.5～6.0制成，所述每100g干基由82.137g麩皮、17.843g豆粕、0.01g硫酸錳和0.01g五水硫酸銅組成。
作為上述α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法的改進(jìn)，在所述發(fā)酵步驟后進(jìn)行后處理步驟將發(fā)酵步驟所得的產(chǎn)物于40℃～45℃的低溫氣流下干燥至水分重量含量為10％，粉碎后即得α-半乳糖苷酶制劑。
本發(fā)明還提供了屬于同一發(fā)明構(gòu)思的另一種α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟1)、孢子懸液的制備將保藏號(hào)為CGMCC No.1628的臭曲霉接種到斜面培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)7天；再用無(wú)菌水制成濃度為106～107個(gè)/ml的孢子懸液，待用；所述斜面培養(yǎng)基為PDA斜面培養(yǎng)基；2)、一級(jí)種子制備首先將液體種子培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照體積比為5％的接種量將孢子懸液接入上述冷卻后的液體種子培養(yǎng)基中，于28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上培養(yǎng)18h，得液體種子；所述液體種子培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基；3)二級(jí)種子制備將固體種子培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照1毫升/10克的接種量將液體種子接入上述冷卻后的固體種子培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6天，得固體種子；所述固體種子培養(yǎng)基由重量比為2∶3的干基和蒸餾水混和后、調(diào)pH至5.5～6.0制成，所述每100g干基由82.137g麩皮、17.843g豆粕、0.01g硫酸錳和0.01g五水硫酸銅組成；4)、α-半乳糖苷酶的發(fā)酵首先將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照重量比為1％的接種量將上述固體種子接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅?8℃培養(yǎng)4～7天；在培養(yǎng)過(guò)程中，于20h時(shí)進(jìn)行混勻振蕩；所述發(fā)酵培養(yǎng)基同固體種子培養(yǎng)基。
作為上述α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法的改進(jìn)，在所述發(fā)酵步驟后進(jìn)行后處理步驟將發(fā)酵步驟所得的產(chǎn)物于40℃～45℃的低溫氣流下干燥至水分重量含量為10％，粉碎后即得α-半乳糖苷酶制劑。
本發(fā)明所選用的保藏號(hào)為CGMCC No.1628的臭曲霉，本申請(qǐng)人已于2006-3-31申請(qǐng)了發(fā)明專利《臭曲霉菌株及其用途》，申請(qǐng)?zhí)?00610050135.4；此次的發(fā)明內(nèi)容是采用統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法對(duì)上述臭曲霉的固體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，從而獲得適合工業(yè)化生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)條件和技術(shù)參數(shù)。
采用本發(fā)明的生產(chǎn)方法，菌株產(chǎn)α-半乳糖苷酶的水平是現(xiàn)有固體發(fā)酵條件下報(bào)道的8～15倍。該酶的最適作用溫度為60℃，較國(guó)內(nèi)報(bào)道的同類酶耐熱；最適pH為5.0，在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性很高，易于應(yīng)用。本發(fā)明采用粗料培養(yǎng)基作為發(fā)酵原料，具有工藝簡(jiǎn)單、酶活性高、單位酶活生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，為α-半乳糖苷酶的低成本化大規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、一種α-半乳糖苷酶生產(chǎn)方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、孢子懸液的制備
將保藏號(hào)為CGMCC No.1628的臭曲霉按照劃線法接種到斜面培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)7天，此時(shí)菌株已成熟；用無(wú)菌水洗下孢子振蕩打散孢子，制成濃度為106～107個(gè)/ml的孢子懸液，待用；所述斜面培養(yǎng)基為PDA斜面培養(yǎng)基，即新鮮馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，蒸餾水1000毫升，pH自然。
2)、一級(jí)種子制備首先將液體種子培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照體積比(V/V)為5％的接種量將孢子懸液接入上述冷卻后的液體種子培養(yǎng)基中，于28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上培養(yǎng)18h，得液體種子；所述液體種子培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基，即新鮮馬鈴薯200克，葡萄糖20克，蒸餾水1000毫升，pH自然。
3)、α-半乳糖苷酶的發(fā)酵在250ml的三角瓶中裝入為10g的干基，此10g干基由8.2137g麩皮、1.7843g豆粕、0.001g硫酸錳和0.001g五水硫酸銅組成。然后向瓶?jī)?nèi)加15g水，再用0.5M的磷酸氫二鈉調(diào)pH至5.5～6.0，制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
三角瓶的瓶口以6層紗布覆蓋，將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌20min后，再冷卻；然后按照1毫升/10克的接種量將上述液體種子接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，?8℃培養(yǎng)4天。在培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)至20h時(shí)，振蕩三角瓶，使得發(fā)酵培養(yǎng)基與液體種子均勻混和，然后靜置直至發(fā)酵結(jié)束。
4)后處理將發(fā)酵結(jié)束后所得的產(chǎn)物于40℃～45℃的低溫氣流下干燥至水分重量含量為10％，粉碎后，包裝成α-半乳糖苷酶制劑。
經(jīng)測(cè)定，α-半乳糖苷酶為酶活為2207.19U/g干曲。
實(shí)施例2一種α-半乳糖苷酶生產(chǎn)方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、孢子懸液的制備將保藏號(hào)為CGMCC No.1628的臭曲霉按照劃線法接種到斜面培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)7天，此時(shí)菌株已成熟；用無(wú)菌水洗下孢子振蕩打散孢子，制成濃度為106～107個(gè)/ml的孢子懸液，待用。所述斜面培養(yǎng)基為新鮮馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂制成的PDA斜面培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
2)、一級(jí)種子制備首先將液體種子培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照體積比為5％的接種量將孢子懸液接入上述冷卻后的液體種子培養(yǎng)基中，于28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上培養(yǎng)18h，得液體種子。所述液體種子培養(yǎng)基為新鮮馬鈴薯-葡萄糖制成的PDA液體培養(yǎng)基；同實(shí)施例1。
3)二級(jí)種子制備在250ml的三角瓶中裝入10g干基，此干基由8.2137g麩皮、1.7843g豆粕、0.001g硫酸錳和0.001g硫酸銅組成。向瓶?jī)?nèi)加15g水，再用0.5M的磷酸氫二鈉調(diào)pH至5.5～6.0，得固體種子培養(yǎng)基。
三角瓶的瓶口以6層紗布覆蓋，將上述固體種子培養(yǎng)基于121℃滅菌20min，再冷卻；然后按照1毫升/10克的接種量將液體種子接入上述冷卻后的固體種子培養(yǎng)基中，振蕩、混勻后于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，得固體種子。在培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)至20h時(shí)，振蕩三角瓶，使得液體種子與固體種子培養(yǎng)基均勻混和，然后靜置直至培養(yǎng)結(jié)束。
4)、α-半乳糖苷酶的發(fā)酵在500ml的三角瓶中裝入為40g的干基，此干基由32.8548g麩皮、7.1372g豆粕、0.004g硫酸錳和0.004g五水硫酸銅組成。再向瓶?jī)?nèi)加60g水，再用0.5M的磷酸氫二鈉調(diào)pH至5.5～6.0，制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
瓶口以6層紗布覆蓋，將發(fā)酵培養(yǎng)基于121℃滅菌20min，再冷卻；然后按照重量比為1％的接種量將上述固體種子接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，?8℃培養(yǎng)7天，在培養(yǎng)過(guò)程中，于20h時(shí)將培養(yǎng)基混勻振蕩，然后靜置發(fā)酵至結(jié)束。
5)、后處理將發(fā)酵步驟所得的產(chǎn)物于40℃～45℃的低溫氣流下干燥至水分重量含量為10％，粉碎后即得α-半乳糖苷酶制劑。
經(jīng)測(cè)定，α-半乳糖苷酶為酶活為2352.74U/g干曲。
實(shí)施例3一種α-半乳糖苷酶生產(chǎn)方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、孢子懸液的制備同實(shí)施例2。
2)、一級(jí)種子制備同實(shí)施例2。
3)二級(jí)種子制備在500ml的三角瓶中裝入40g干基，此干基由32.855g麩皮、7.137g豆粕、0.004g硫酸錳和0.004g硫酸銅組成。向瓶?jī)?nèi)加60g水，再用0.5M的磷酸氫二鈉調(diào)pH至5.5～6.0，得固體種子培養(yǎng)基。
將培養(yǎng)天數(shù)改成6天，其余同實(shí)施例2。
4)、α-半乳糖苷酶的發(fā)酵
同實(shí)施例2。
5)、后處理同實(shí)施例2。
經(jīng)測(cè)定，α-半乳糖苷酶為酶活為1928.24U/g干曲。
上述實(shí)施例中，酶的提取及活性測(cè)定方法如下將發(fā)酵步驟后所得的固體物用攪拌機(jī)攪拌均勻，稱取1g左右，加入0.2M，pH5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在45℃的水浴搖床上振蕩30min，濾紙過(guò)濾得粗酶液。用緩沖液稀釋一定倍數(shù)以測(cè)定酶活。
α-半乳糖苷酶的測(cè)定如下將適當(dāng)稀釋的酶液0.1ml，加入pH 5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液0.05ml，10mmol/L對(duì)硝基苯α-D-半乳吡喃糖苷0.05ml，于50℃水浴條件下，反應(yīng)10min，然后加入3.0ml的0.25mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在400nm下OD值。
酶活力單位定義在pH5.0，溫度為50℃的條件下，每分鐘生成1μmol對(duì)-硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征包括以下步驟1)、孢子懸液的制備將保藏號(hào)為CGMCC No.1628的臭曲霉接種到斜面培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)7天；再用無(wú)菌水制成濃度為106～107個(gè)/ml的孢子懸液，待用；所述斜面培養(yǎng)基為PDA斜面培養(yǎng)基；2)、一級(jí)種子制備首先將液體種子培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照體積比為5％的接種量將孢子懸液接入上述冷卻后的液體種子培養(yǎng)基中，于28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上培養(yǎng)18h，得液體種子；所述液體種子培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基；3)、α-半乳糖苷酶的發(fā)酵首先將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照1毫升/10克的接種量將上述液體種子接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，?8℃培養(yǎng)4～7天，在培養(yǎng)過(guò)程中，于20h時(shí)進(jìn)行混勻振蕩發(fā)酵培養(yǎng)基的步驟；所述發(fā)酵培養(yǎng)基由重量比為2∶3的干基和蒸餾水混和后、調(diào)pH至5.5～6.0制成，所述每100g干基由82.137g麩皮、17.843g豆粕、0.01g硫酸錳和0.01g五水硫酸銅組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是在所述發(fā)酵步驟后進(jìn)行后處理步驟將發(fā)酵步驟所得的產(chǎn)物于40℃～45℃的低溫氣流下干燥至水分重量含量為10％，粉碎后即得α-半乳糖苷酶制劑。
3.α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征包括以下步驟1)、孢子懸液的制備將保藏號(hào)為CGMCC No.1628的臭曲霉接種到斜面培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)7天；再用無(wú)菌水制成濃度為106～107個(gè)/ml的孢子懸液，待用；所述斜面培養(yǎng)基為PDA斜面培養(yǎng)基；2)、一級(jí)種子制備首先將液體種子培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照體積比為5％的接種量將孢子懸液接入上述冷卻后的液體種子培養(yǎng)基中，于28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上培養(yǎng)18h，得液體種子；所述液體種子培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基；3)二級(jí)種子制備將固體種子培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照1毫升/10克的接種量將液體種子接入上述冷卻后的固體種子培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6天，得固體種子；所述固體種子培養(yǎng)基由重量比為2∶3的干基和蒸餾水混和后、調(diào)pH至5.5～6.0制成，所述每100g干基由82.137g麩皮、17.843g豆粕、0.01g硫酸錳和0.01g五水硫酸銅組成；4)、α-半乳糖苷酶的發(fā)酵首先將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20min滅菌，再冷卻；然后按照重量比為1％的接種量將上述固體種子接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，?8℃培養(yǎng)4～7天；在培養(yǎng)過(guò)程中，于20h時(shí)進(jìn)行混勻振蕩；所述發(fā)酵培養(yǎng)基同固體種子培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的α-半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是在所述發(fā)酵步驟后進(jìn)行后處理步驟將發(fā)酵步驟所得的產(chǎn)物于40℃～45℃的低溫氣流下干燥至水分重量含量為10％，粉碎后即得α-半乳糖苷酶制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種α－半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟1)孢子懸液的制備，2)一級(jí)種子制備，3)α－半乳糖苷酶的發(fā)酵。本發(fā)明還公開(kāi)了同一發(fā)明構(gòu)思下的另一種α－半乳糖苷酶固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟1)孢子懸液的制備，2)一級(jí)種子制備，3)二級(jí)種子制備，4)α－半乳糖苷酶的發(fā)酵。采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)α－半乳糖苷酶，產(chǎn)酶活力高、工藝簡(jiǎn)單、易于生產(chǎn)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/66GK1900277SQ20061005257
公開(kāi)日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者劉彩琴, 何國(guó)慶, 陳啟和, 阮暉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)