高密度細胞存儲方法
【專利說明】高密度細胞存儲方法
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2013年3月15日遞交的美國臨時申請No. 61/793,021的優(yōu)先權(quán)，將 其內(nèi)容通過提述以其整體并入本文用于全部用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 常規(guī)細胞存儲（cellbanking)廣泛用于保存冷凍的、特征性的細胞，這些細 胞可能被解凍用于多種應(yīng)用，包括治療相關(guān)蛋白的生產(chǎn)。通常而言，將冷凍保存的儲液 (cryopreservedstock)以較低的密度保存，或者離心以生成更高密度的等分試樣用于儲 存。較低密度的儲液不允許有效接種大體積的培養(yǎng)物，而基于離心的濃縮方法對于細胞可 以是非常有破壞性的（在冷凍保存過程期間細胞會變得更加脆弱）。因此，需要改進的細胞 存儲方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本公開提供了改進的創(chuàng)建細胞庫的方法。在某些方面，本發(fā)明的細胞存儲方法采 用灌注培養(yǎng)技術(shù)和細胞的非離心濃縮以允許以出乎意料高的細胞密度進行冷凍保存，同時 保持出色的細胞活力以供稍后在生產(chǎn)細胞培養(yǎng)物中使用。
[0005] 因此，在一方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生高密度冷凍細胞庫的非離心方法，所述方法 包括：a)在灌注生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞，其中所述生物反應(yīng)器與細胞保留系統(tǒng)偶聯(lián)；b)以 非離心的方式濃縮所述細胞以產(chǎn)生濃縮的細胞群體；和c)冷凍保存濃縮的細胞群體以產(chǎn) 生高密度冷凍細胞庫。
[0006] 在一個實施方案中，所述細胞保留系統(tǒng)包含交替切向流過濾系統(tǒng)（alternating tangentialflowfiltrationsystem)，所述交替切向流過濾系統(tǒng)包含過濾器。在另一個 實施方案中，所述過濾器具有至少〇. 3m2的表面積。在另一個實施方案中，所述過濾器具有 約0. 5至約I.Om2的表面積。在另一個實施方案中，所述過濾器具有約0. 7至約0.Sm2的表 面積。在另一個實施方案中，所述過濾器具有約2.0至約3.Om2的表面積。在另一個實施 方案中，所述過濾器具有約4至約5m2的表面積。
[0007] 在一個實施方案中，所述過濾器具有約0. 2ym的孔徑。
[0008] 在一個實施方案中，所述濃縮的細胞群體具有至少約Ix10~8個細胞/mL的細胞 密度。
[0009] 在一個實施方案中，所述濃縮的細胞群體具有約Ix10~8個細胞/mL的細胞密度。
[0010] 在一個實施方案中，所述冷凍保存包括以約5 %至約10 %體積/體積的終濃度將 DMSO添加至濃縮的細胞群體。在另一個實施方案中，所述冷凍保存包括將至少一部分濃縮 的細胞群體冷凍在適合于在冷凍保存條件下儲存的容器中。
[0011] 在一個實施方案中，所述容器是小瓶。在一個實施方案中，所述容器具有至少2mL 的體積。在一個實施方案中，所述容器具有約5mL的體積。
[0012] 在一個實施方案中，所述高密度冷凍細胞庫包含約4. 5xKT8個細胞。
[0013] 在一個實施方案中，所述容器是冷凍袋。在另一個實施方案中，冷凍袋具有約5至 約150mL的體積。
[0014] 在一個實施方案中，所述高密度冷凍細胞庫具有約lxKT8個細胞/mL的細胞密 度。
[0015] 在一個實施方案中，所述灌注生物反應(yīng)器中的灌注速率為至少約0.2nL/細胞/ 天。
[0016] 在一個實施方案中，所述灌注生物反應(yīng)器細胞培養(yǎng)物具有約7的pH和至少約40% 的溶解氧濃度。
[0017] 在一個實施方案中，所述生物反應(yīng)器是柔性袋式生物反應(yīng)器。在另一個實施方案 中，所述柔性袋式生物反應(yīng)器具有IOL的體積。在另一個實施方案中，所述柔性袋式生物反 應(yīng)器具有至少20L的體積。在另一個實施方案中，所述柔性袋式生物反應(yīng)器進一步包含至 少一個汲取管（diptube)。
[0018] 在一個實施方案中，所述高密度冷凍細胞庫具有至少60%的解凍后活力。在另一 個實施方案中，所述高密度冷凍細胞庫具有至少90 %的解凍后活力。在另一個實施方案中， 所述高密度冷凍細胞庫具有至少95 %的解凍后活力。
[0019] 在一個實施方案中，所述細胞是哺乳動物細胞。在另一個實施方案中，所述哺乳動 物細胞選自下組：CHO、CHO-DBXl1、CH0-DG44、CHO-S、CHO-Kl、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、 HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NSO、CRL7030、HsS78Bst細胞、 PER.C6、SP2/0-Agl4和雜交瘤細胞。
[0020] 在一個實施方案中，所述細胞是經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞。
[0021] 在一個方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生高密度冷凍細胞庫的非離心方法，所述方法包 括：a)在灌注生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞，所述灌注生物反應(yīng)器偶聯(lián)至交替切向流過濾系統(tǒng)， 其中所述生物反應(yīng)器包含柔性袋式生物反應(yīng)器，并且其中所述過濾器具有至少〇. 3m2的過 濾器表面積，和具有至少50kDa的MffCO尺寸的過濾器；b)使用交替切向流過濾系統(tǒng)以非離 心的方式濃縮所述細胞，以產(chǎn)生具有約lxKT8個細胞/mL的密度的濃縮的細胞群體；c) 冷凍保存濃縮的細胞群體以產(chǎn)生高密度冷凍細胞庫，其中所述冷凍保存包括以約5%至約 10 %體積/體積的終濃度將DMSO添加至濃縮的細胞群體；并且其中所述高密度冷凍細胞庫 具有約lxKT8個細胞/mL的細胞密度。
[0022] 在一個實施方案中，所述培養(yǎng)物的pH和DO通過自動化方法控制。
[0023] 在一個實施方案中，所述培養(yǎng)物的pH和DO通過非自動化方法控制。在另一個實施 方案中，所述PH和DO通過以下中的任何一種或多種控制：調(diào)節(jié)引入至所述培養(yǎng)物中的氣體 的混合物，調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器的搖動速率（rockrate)，或調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器的搖動角度（rock angle)〇
[0024] 在一個實施方案中，所述生物反應(yīng)器以15rpm并以8°的搖動角度搖動。
[0025] 因此，在一個方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生高密度冷凍細胞庫的非離心方法，所述方 法包括：a)在灌注生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞，其中將所述生物反應(yīng)器偶聯(lián)至細胞保留系統(tǒng)； b)以非離心的方式濃縮所述細胞以產(chǎn)生濃縮的細胞群體；和c)冷凍保存濃縮的細胞群體 以產(chǎn)生高密度冷凍細胞庫。
[0026] 在一個實施方案中，所述細胞保留系統(tǒng)包含交替切向流過濾系統(tǒng)，所述交替切向 流過濾系統(tǒng)包含過濾器。在另一個實施方案中，所述過濾器具有至少0.3m2的表面積。在 另一個實施方案中，所述過濾器具有約〇. 5m2至約I.Om2的表面積。在另一個實施方案中， 所述過濾器具有約0. 7至約0.Sm2的表面積。在另一個實施方案中，所述過濾器具有約2. 0 至約3.Om2的表面積。在另一個實施方案中，所述過濾器具有約4至約5m2的表面積。
[0027] 在一個實施方案中，所述過濾器約0. 2ym的孔徑。
[0028] 在一個實施方案中，所述濃縮的細胞群體具有至少約I.Ix1(T8個細胞/mL的細 胞密度。
[0029] 在一個實施方案中，所述濃縮的細胞群體具有約I.Ix1(T8個細胞/mL的細胞密 度。
[0030] 在一個實施方案中，所述冷凍保存包括以約5%至約10 %體積/體積（vol/vol) 的終濃度將DMSO添加至濃縮的細胞群體。在另一個實施方案中，所述冷凍保存包括將至少 一部分濃縮的細胞群體冷凍在適合于在冷凍保存條件下儲存的容器中。
[0031] 在一個實施方案中，所述容器是小瓶。在一個實施方案中，所述容器具有至少2mL 的體積。在一個實施方案中，所述容器具有至少約5mL的體積。
[0032] 在一個實施方案中，所述高密度冷凍細胞庫包含約4. 5xKT8個細胞。
[0033] 在一個實施方案中，所述容器是冷凍袋。在另一個實施方案中，冷凍袋具有約5至 約150mL的體積。
[0034] 在一個實施方案中，所述高密度冷凍細胞庫具有約Ix10~8個細胞/mL的細胞密 度。
[0035] 在一個實施方案中，所述灌注生物反應(yīng)器中的灌注速率為至少約0. 2nL/細胞/ 天。
[0036] 在一個實施方案中，所述灌注生物反應(yīng)器細胞培養(yǎng)物具有約7的pH和至少約40% 的溶解氧濃度。
[0037] 在一個實施方案中，所述生物反應(yīng)器是柔性袋式生物反應(yīng)器。在另一個實施方案 中，所述柔性袋式生物反應(yīng)器具有IOL的體積。在另一個實施方案中，所述柔性袋式生物反 應(yīng)器具有至少20L的體積。在另一個實施方案中，所述柔性袋式生物反應(yīng)器進一步包含至 少一個汲取管（diptube)。
[0038] 在一個實施方案中，所述高密度冷凍細胞庫具有至少60%的解凍后活力。在另一 個實施方案中，所述高密度冷凍細胞庫具有至少90 %的解凍后活力。在另一個實施方案中， 所述高密度冷凍細胞庫具有至少95 %的解凍后活力。
[0039] 在一個實施方案中，所述細胞是哺乳動物細胞。在另一個實施方案中，所述哺乳動 物細胞選自下組：CHO、CHO-DBXl1、CH0-DG44、CHO-S、CHO-Kl、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、 HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NSO、CRL7030、HsS78Bst細胞、 PER.C6、SP2/0-Agl4和雜交瘤細胞。
[0040] 在一個實施方案中，所述細胞是經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞。
[0041] 在一個方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生高密度冷凍細胞庫的非離心方法，所述方法包 括：a)在灌注生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞，所述灌注生物反應(yīng)器偶聯(lián)至交替切向流過濾系統(tǒng)， 其中所述生物反應(yīng)器包含柔性袋式生物反應(yīng)器，并且其中所述過濾器具有至少〇. 3m2的過 濾器表面積，和具有至少50kDa的MffCO尺寸的過濾器；b)使用交替切向流過濾系統(tǒng)以非離 心的方式濃縮所述細胞，以產(chǎn)生具有約I.IxKT8個細胞/mL的密度的濃縮的細胞群體；c) 冷凍保存所述濃縮的細胞群體以產(chǎn)生高密度冷凍細胞庫，其中所述冷凍保存包括以約5% 至約10%體積/體積的終濃度將DMSO添加至濃縮的細胞群體；并且其中所述高密度冷凍 細胞庫具有約lxKT8個細胞的細胞密度。
[0042] 在一個實施方案中，所述培養(yǎng)物的pH和DO通過自動化方法控制。
[0043] 在一個實施方案中，所述培養(yǎng)物的pH和DO通過非自動化方法控制。在另一個實 施方案中，所述PH和DO通過以下中的任何一種或多種控制：調(diào)節(jié)引入至所述培養(yǎng)物中的氣 體的混合物，調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器的搖動速率，或調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器的搖動角度。
[0044] 在一個實施方案中，所述生物反應(yīng)器以15rpm以8°的搖動角度搖動。
[0045] 在一個方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生高密度冷凍細胞庫的非離心方法，所述方法包 括：a)在灌注生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞，其中攪拌所述生物反應(yīng)器以進行有效的混合和氣體 交換，其中將所述生物反應(yīng)器偶聯(lián)至細胞保留系統(tǒng)；b)以非離心的方式濃縮所述細胞以產(chǎn) 生濃縮的細胞群體；和c)冷凍保存濃縮的細胞群體以產(chǎn)生高密度冷凍細胞庫。
[0046] 在一個實施方案中，所述細胞保留系統(tǒng)包含交替切向流過濾系統(tǒng)，所述交替切向 流過濾系統(tǒng)包含過濾器。在另一個實施方案中，所述過濾器具有至少〇. 3m2的表面積。在另 一個實施方案中，所述過濾器具有約〇. 5至約I.Om2的表面積。在另一個實施方案中，所述 過濾器具有約〇. 7至約0.Sm2的表面積。在另一個實施方案中，所述過濾器具有約2. 0至 約3.Om2的表面積。在另一個實施方案中，所述過濾器具有約4至約5m2的表面積。
[0047] 在一個實施方案中，所述過濾器具有選自0. 2ym、0. 4ym和0. 65ym的孔徑。
[0048] 在一個實施方案中，所述濃縮的細胞群體具有選自LOx10~8個細胞/mL、l.Ix 1(T