含有環(huán)狀酰亞胺的肽產(chǎn)物的合成的制作方法
【專利說(shuō)明】含有環(huán)狀酰亞胺的肽產(chǎn)物的合成
[0001] 本發(fā)明涉及合成包含至少一個(gè)環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)的肽產(chǎn)物的方法。此外，本發(fā)明涉 及基本上不含降解產(chǎn)物的包含至少一個(gè)環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)的肽產(chǎn)物。該肽產(chǎn)物可以用作用于 質(zhì)量控制藥物肽的參比物質(zhì)，具體地為用于質(zhì)量控制GLP-I激動(dòng)劑如毒蜥外泌肽（exendin peptide)的參比物質(zhì)。
[0002] 使用熟知的重組DNA和化學(xué)固相合成方法，已經(jīng)合成了用于制藥的若干蛋白和 肽。然而這些蛋白和肽的生產(chǎn)通常導(dǎo)致大量不期望的合成副產(chǎn)物。這在它們通過(guò)固相合成 而產(chǎn)生時(shí)尤其如此。隨著肽/蛋白長(zhǎng)度的增加，導(dǎo)致了合成步驟的增加，這些副產(chǎn)物可占粗 產(chǎn)物的50至70%。
[0003] 副產(chǎn)物可能包括含有環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)如天冬酰亞胺或戊二酰亞胺 的肽產(chǎn)物。這樣的環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)生成于固相合成期間或之后，例如，當(dāng)從 固相載體除去肽時(shí)或當(dāng)配制或存儲(chǔ)肽組合物時(shí)（Geiger&Clarke,J.Biol. Chem.262(1987), 785-794；Hekman et al.,JPharm. Biomed. Anal.20(1999), 763-772 ； Lindner&Helliger,Exp.Gerontol.36 (2001), 1551-1563；Aswad et al.,J. Pharm.Biomed. Anal.21 (2000), 1129-1136 ；Ritz-Timme&Collins, Ageing Res. Rev.I(2002), 43-59；Mergler et al.,J.Pept. Sci.9 (2003), 36-46；Mergler et al.,J. Pept.Sci.9 (2003), 518-526:Mergler et al.,J.Pept. Sci.I(2005), 650-657；Cebrian et al.，J.Pept. Res.62 (2003)，238-244;De Boni et al.，J.Chrom. A.1022 (2004)，95-102;和 Houchin et al.,J.Contr. Release112 (2006),111-119)〇
[0004] 含有環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)的肽產(chǎn)物的靶向合成是未知的。過(guò)去，天冬酰亞胺或戊二酰 亞胺已經(jīng)通過(guò)"強(qiáng)制降解"方法產(chǎn)生，其中含有氨基酸Asp或Asn的肽經(jīng)歷降解條件，例如 在pH4或pH8條件下和任選在約40至約50°C的升高的溫度下攪拌1-2天。但是，這些方 法具有以下缺點(diǎn)：除了所需產(chǎn)物之外，得到了大量的其他降解產(chǎn)物。具體地，環(huán)狀酰亞胺基 團(tuán)會(huì)經(jīng)歷進(jìn)一步的反應(yīng)，例如外消旋化，形成異天冬氨酸肽，從Asn轉(zhuǎn)化成Asp，親核試劑打 開天冬酰亞胺，肽鍵斷開，等。因此，在實(shí)施強(qiáng)制降解之后，常常難以將所需的環(huán)狀酰亞胺產(chǎn) 物從含肽化合物的復(fù)雜混合物中純化出來(lái)。
[0005] 為了克服這些在制造和純化環(huán)狀酰亞胺肽產(chǎn)物中的困難，本發(fā)明人研發(fā)了用于含 環(huán)狀酰亞胺的肽的靶向合成。
[0006]該方法以肽利西拉來(lái)（AVE0010)，即一種具有44個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的GLP-I激動(dòng)劑，作 為示例進(jìn)行顯示。利西拉來(lái)的氨基酸序列示于SEQIDN0:1中：
[0007]H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-
[0008] G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
[0009] 利西拉來(lái)通過(guò)化學(xué)固相合成方法來(lái)制備。
[0010] 天冬酰亞胺可以從肽序列-Asn-X-或-Asp-X-(其中X表示C-末端鄰接的氨基酸 殘基）形成。在前一種情況中，環(huán)化涉及除去氨（NH3),在后一種情況中，涉及除去水（H20)。 在圖1中，顯示了在AVE0010中即在位置-Asn(28)-Gly(29)-和Asp(9)-Leu(10)上形成天 冬酰亞胺。所得產(chǎn)物分別標(biāo)記為[Asp(9)-H20]-AVE0010和[Asn(28)-NH3]-AVE0010。原則 上，相同的反應(yīng)導(dǎo)致形成從氨基酸Gln或Glu形成戊二酰亞胺。
[0011] 本發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，在合成肽期間在偶聯(lián)步驟中當(dāng)在需要形成環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)的 預(yù)定位置上使用具有不受保護(hù)的COOH或0)順2側(cè)鏈的氨基酸構(gòu)造塊（buildingblocks)例 如Asp、Asn或Glu、Gln時(shí)，靶向合成環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)是可行的。在不需要形成環(huán)狀酰亞胺 基團(tuán)的其他位置上，可以在合成中使用具有受保護(hù)的COOH或0)順2側(cè)鏈的氨基酸構(gòu)造塊。 通過(guò)增加偶聯(lián)時(shí)間和重復(fù)添加偶聯(lián)試劑，環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)可以幾乎定量的產(chǎn)率得到。因此， 本發(fā)明允許在肽序列的預(yù)定位置選擇性形成環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)，而不影響可能易于形成環(huán)狀 酰亞胺基團(tuán)的肽序列的其他位置。
[0012] 在圖2中顯示了形成天冬酰亞胺基團(tuán)。將具有未經(jīng)保護(hù)的羧基側(cè)鏈的受氨基保護(hù) (例如Fmoc)的Asp構(gòu)造塊在偶聯(lián)試劑的存在下添加至具有游離氨基的載體樹脂連接的肽 衍生物。天冬酰亞胺基團(tuán)的形成通過(guò)將偶聯(lián)時(shí)間增加至多1天并重復(fù)添加偶聯(lián)試劑而得到 促進(jìn)。肽合成的其他步驟，即，在先和/或后續(xù)步驟，可以在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行。但是，應(yīng)當(dāng)避 免使用用于斷開Fmoc保護(hù)基的哌啶，因此這會(huì)導(dǎo)致天冬酰亞胺環(huán)的開環(huán)。
[0013] 本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了以高產(chǎn)率和純度靶向合成環(huán)狀酰亞胺肽產(chǎn)物。這些肽產(chǎn)物可 以例如用作質(zhì)量控制藥物肽產(chǎn)物如利西拉來(lái)的參比物質(zhì)。
[0014] 本發(fā)明的一個(gè)主題是包含至少一個(gè)式（I)的環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)的肽產(chǎn)物或
[0015] 其鹽或溶劑化物的合成方法，
[0016]
[0017] 其中
[0018] 札為1或2個(gè)原子長(zhǎng)度的橋（或二價(jià)自由基），
[0019] 私為氨基酸側(cè)鏈，
[0020] *表示不對(duì)稱C原子，優(yōu)選為L(zhǎng)-構(gòu)型，以及
[0021] (*)表示任選不對(duì)稱的C原子，優(yōu)選為L(zhǎng)-構(gòu)型，
[0022] 所述方法包括以下步驟：
[0023] (a)在其中形成式⑴的環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)的條件下將式（II)的合成構(gòu)造塊偶聯(lián)至 式（III)的肽產(chǎn)物，
[0024] 所述式（II)為
[0025]
[0026] 其中
[0027] X為氨基保護(hù)基，
[0028]Y為未經(jīng)保護(hù)的羧基或甲酰氨基，
[0029]Z為羧基，以及
[0030] *表示不對(duì)稱的C原子，優(yōu)選為L(zhǎng)-構(gòu)型，
[0031] 所述式（III)為
[0032]
[0033] 其中
[0034] R2'為任選保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈，
[0035] R3為含肽殘基，優(yōu)選結(jié)合至固相載體，和
[0036] (*)表示任選不對(duì)稱的C原子，優(yōu)選為L(zhǎng)-構(gòu)型，
[0037] (b)斷開氨基保護(hù)基X，
[0038] (c)任選持續(xù)肽合成，以及
[0039] (d)任選純化肽產(chǎn)物（I)。
[0040] 本發(fā)明的另一主題為包含至少一個(gè)式（I)的環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)的肽產(chǎn)物或其鹽或 溶劑化物：
[0041 ]
[0042] 其中
[0043]札為1或2個(gè)原子長(zhǎng)度的橋（或二價(jià)自由基），
[0044] 私為氨基酸側(cè)鏈，
[0045] *表示不對(duì)稱的C原子，和
[0046] (*)表示任選不對(duì)稱的C原子。
[0047] 特別地，肽產(chǎn)物為GLP-激動(dòng)劑，如毒蜥外泌肽，更具體為利西拉來(lái)（AVE0010)。
[0048] 本發(fā)明的進(jìn)一步的主題為如上所述的式（I)的肽產(chǎn)物或其鹽或溶劑化物作為用 于質(zhì)量控制藥物肽、特別是GLP-I激動(dòng)劑肽如毒蜥外泌肽如利西拉來(lái)的參比物質(zhì)的用途。
[0049] 本發(fā)明的再一個(gè)主題為用于確定利西拉來(lái)（AVE0010)產(chǎn)物組合物中的雜質(zhì)的量 的試劑盒，其包含：
[0050] (i)至少一種[Asp(9)-H2O]-AVE0010 的備制劑（stockpreparation)，和 / 或
[0051] (ii)至少一種[Asn(28)-NH3]-AVEOO10 的貯備制劑。
[0052] 本發(fā)明的再一個(gè)主題為用于質(zhì)量控制組合物的方法，所述組合物包含藥物肽產(chǎn) 物，具體為GLP-I激動(dòng)劑肽產(chǎn)物例如毒蜥外泌肽產(chǎn)物，更具體是利西拉來(lái)（AVE0010)產(chǎn)物， 所述方法包括定量確定具有式（I)的環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)的肽產(chǎn)物或其鹽或溶劑化物在所述 組合物中的量。
[0053] 本發(fā)明涉及合成肽產(chǎn)物的方法。術(shù)語(yǔ)〃肽產(chǎn)物〃涵蓋具有至少5個(gè)或至少10個(gè) 氨基酸以及至多50個(gè)或至多100個(gè)氨基酸或甚至更長(zhǎng)的長(zhǎng)度的肽和蛋白。肽產(chǎn)物可由基 因編碼的氨基酸構(gòu)造塊組成，或可包含非基因編碼的氨基酸構(gòu)造塊，例如非天然存在的氨 基酸、D-氨基酸或化學(xué)修飾的氨基酸，或可由例如通過(guò)二硫橋連接的若干肽鏈組成。肽產(chǎn) 物可進(jìn)一步含有在N-和/或C-末端和/或在側(cè)鏈的修飾，例如?；Ⅴ０坊蛱砑臃请膫?cè) 鏈基團(tuán)諸如親脂基團(tuán)。肽產(chǎn)物可為線性的或環(huán)狀的。優(yōu)選地，肽產(chǎn)物具有5-100個(gè)氨基酸 的長(zhǎng)度。
[0054] 本發(fā)明的肽產(chǎn)物可為鹽例如藥用鹽，或溶劑化物例如水合物的形式。藥用鹽的實(shí) {列描述于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy, (20thed.)ed.A.R.Gennaro A.R. , 2000,LippencottWilIiams&ffilkinsorinHandbookofPharmaceutical Salts,Properties,SelectionandUse,e.d.P.H.Stahl,C.G.ffermuth, 2002,jointly publishedbyVerlagHelveticaChimicActa,Zurich,Switzerland,and Wiley-VCH,Weinheim,Germany。優(yōu)選地，所述鹽為三氟乙酸鹽或乙酸鹽。
[0055] 肽產(chǎn)物包含至少一種能夠形成式（I)的環(huán)狀酰亞胺基團(tuán)的氨基酸殘基，特別是具 有帶有羧基或羧酰胺基團(tuán)的側(cè)鏈的氨基酸殘基如Asp、Asn、Glu或Gln，在N-末端連接至在 肽鏈中具有可用于環(huán)化的N-原子的氨基酸殘基。位于C-末端的氨基酸殘基可以例如選 自D構(gòu)型或L構(gòu)型的Gly、Leu、His、Asp、Arg、Phe、Ala