一種真菌菌絲體液體深層發(fā)酵中產(chǎn)生的胞內(nèi)酶的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種真菌菌絲體液體深層發(fā)酵中產(chǎn)生 的胞內(nèi)酶的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 靈芝是一種極其珍貴的藥用真菌，具有多種生理功能和寶貴的藥用價(jià)值。靈芝子 實(shí)體中所含有的多種生物活性物質(zhì)，如靈芝多糖、靈芝三萜以及多種酶類(lèi)等，同時(shí)存在于液 體培養(yǎng)的菌絲體中。
[0003] 傳統(tǒng)上，靈芝是通過(guò)野外采集或人工栽培獲得，以子實(shí)體或孢子入藥，但靈芝子實(shí) 體形成周期長(zhǎng)，所需勞動(dòng)強(qiáng)度大。通過(guò)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)可加速菌絲生成，縮短生長(zhǎng)周期。 液體深層發(fā)酵技術(shù)具有生產(chǎn)量大、占地少、周期短、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、容易控制等優(yōu)點(diǎn)，并且， 有些目前不能栽培的食用菌也可以通過(guò)液體深層發(fā)酵的方法生產(chǎn)菌絲體和其它代謝產(chǎn)物。
[0004] 申請(qǐng)公布號(hào)為CN102488719A的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)文獻(xiàn)公開(kāi)了一種利用中藥提取物提 高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，該方法在靈芝菌絲體液體發(fā)酵時(shí)，采用含中藥提 取物的培養(yǎng)基進(jìn)行靈芝菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)，具體包括：稱(chēng)取中藥材，制備中藥提取物；向 PDA培養(yǎng)基中加入步驟1制備的中藥提取物，制備含有中藥提取物的PDA培養(yǎng)基；向步驟 (2)制備的含有中藥提取物的PDA培養(yǎng)基中接入靈芝菌種，菌種接種量為5~15%留在溫 度28~30°C，轉(zhuǎn)速120~150r/min條件下，搖床培養(yǎng)7~10d。
[0005] 研究表明，靈芝、香菇等擔(dān)子菌具有較好的產(chǎn)P-葡萄糖苷酶活性，P-葡萄糖苷 酶的特性是可水解結(jié)合于末端非還原性的0 -D-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出P-葡萄糖和相 應(yīng)的配基，所以廣泛用于大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化。
[0006] 另外，靈芝在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的菌絲，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在靈芝發(fā)酵過(guò)程中有一部 分酶被釋放到發(fā)酵液中，而還有一部分存在于靈芝菌絲體中，因此需要對(duì)靈芝菌絲體細(xì)胞 進(jìn)行破碎處理，使酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)，從而提高其酶的活力。
[0007] 目前，細(xì)胞破碎的方式有很多，例如高壓勻漿、研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎、滲透壓 沖擊、酶溶、化學(xué)滲透等。但是，上述常規(guī)方法易造成破碎過(guò)程中酶活的損失，以及存在經(jīng) 濟(jì)、安全等不利因素；
[0008] 因此，有必要提供一種更為溫和的提取方法，以改善上述問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種真菌菌絲體液體深層發(fā)酵中產(chǎn)生的胞內(nèi)酶的提取方法，該方法 操作簡(jiǎn)單，效果顯著，酶活損失少，同時(shí)適用于各類(lèi)真菌菌絲體發(fā)酵產(chǎn)酶的提取。
[0010] -種真菌菌絲體液體深層發(fā)酵中產(chǎn)生的胞內(nèi)酶的提取方法，該方法包括：取發(fā)酵 液，分離得到菌絲體，菌絲體用水稀釋后，依次進(jìn)行打漿處理、超聲破碎處理，得到粗酶液。
[0011] 上述分離菌絲體和發(fā)酵液的方法為抽濾，而非離心，因?yàn)榭墒构桃悍蛛x得更為徹 底，同時(shí)避免了菌絲體因離心升溫而造成的酶活的損失。
[0012] 上述打漿處理以及超聲破碎處理均處于冰水浴中進(jìn)行。菌絲體先經(jīng)打漿處理，以 打散并破碎菌絲球，再進(jìn)行超聲破碎處理，以破碎菌絲細(xì)胞。
[0013] 作為優(yōu)選，所述打漿處理的溫度為-10~KTC，時(shí)間為0. 5~I.Omin。
[0014] 作為優(yōu)選，所述打漿處理的轉(zhuǎn)速為20000~21000r/min。
[0015] 更優(yōu)選，打衆(zhòng)處理過(guò)程中，打衆(zhòng)處理過(guò)程中，打衆(zhòng)0. 5~I.Omin后間歇1~2min; 進(jìn)一步優(yōu)選，打衆(zhòng)處理過(guò)程中，打衆(zhòng)I.Omin后間歇Imin。
[0016] 作為優(yōu)選，所述超聲破碎處理的超聲功率為180~220W。
[0017] 作為優(yōu)選，所述超聲破碎處理的溫度為-10~KTC，時(shí)間為5~lOmin。
[0018] 更優(yōu)選，超聲破碎處理過(guò)程中，每超聲破碎1~2min間歇1~2min，超聲的次數(shù)為 4~6次。
[0019] 本發(fā)明所述的真菌為藥用真菌或者食用真菌；具體指，靈芝、香菇或灰樹(shù)花；更優(yōu) 選，所述的真菌為靈芝。
[0020] 所述的胞內(nèi)酶為(6-葡萄糖苷酶。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0022] (1)本發(fā)明采用打漿處理和超聲破碎處理結(jié)合的方法，獲取真菌菌絲體液體深層 發(fā)酵中產(chǎn)生的胞內(nèi)酶的粗酶液，酶活損失少；
[0023] (2)本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，方便可行，適用于多種真菌菌絲體液體深層發(fā)酵產(chǎn)酶的 提取，如靈芝、香菇、灰樹(shù)花等。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的方法。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不限制其范圍。
[0025] (1)菌種培養(yǎng)方法
[0026] 斜面菌種活化：將一代靈芝菌接種至斜面培養(yǎng)基上，放置28°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 至斜面長(zhǎng)滿菌絲體為止，一股6-8天。
[0027] 種子制備：250mL三角瓶中裝IOOmL液體種子培養(yǎng)基，用接種鏟刮取法接入經(jīng)活化 的斜面靈芝兩試管，放置28°C搖床中，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)7天，供實(shí)驗(yàn)作種子用。
[0028] 菌種發(fā)酵：250mL三角瓶中裝IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10%，搖床轉(zhuǎn)速180r/ min，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時(shí)間5-10天。
[0029] (2)培養(yǎng)基
[0030] 斜面培養(yǎng)基：PDA4. 5%、瓊脂 1. 7%、KH2PO4O. 3%、MgSO4O. 15%、VbiO. 005%。
[0031] 種子培養(yǎng)基：PDB3. 5 %、蛋白胨0? 5 %、酵母浸粉0? 3 %、KH2PO4O. 3 %、 MgSO4O. 15%、VbiO. 005%、pH5. 5。
[0032] 發(fā)酵培養(yǎng)基：22麥芽汁27%、豆柏粉6%、腿2?040 . 3%、]\%5040.15%、￥810.005%。、 pH5. 5 〇
[0033] (3)酶活測(cè)定方法
[0034] 本發(fā)明采用比色法，以對(duì)硝基苯基-P-D-葡萄糖苷（pNPG)為底物進(jìn)行酶解，底物 水解后釋放出來(lái)的對(duì)硝基苯酚在400-420nm可見(jiàn)光范圍內(nèi)有特征吸收峰，可直接在400~ 420nm之間比色測(cè)定。
[0035] 酶活定義：(6-葡萄糖苷酶酶活力單位（U)定義為，在pH5.0,50°C反應(yīng)條件下，一 分鐘時(shí)間內(nèi)底物被水解釋放出Iymol的pNP所需要的酶量。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 本實(shí)施例采用赤芝作為菌種，該菌種購(gòu)于河南省科學(xué)院食用菌工程技術(shù)中心。
[0038] 1、菌絲體與發(fā)酵液的分離
[0039] 將赤芝按照上述菌種培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵8天后，進(jìn)行抽濾，分離菌絲體 和發(fā)酵液