專利名稱：一種從真菌菌絲體中提取有效成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從真菌菌絲體中提取有效成份的方法。該有效成份代號(hào)為中華808，具有促進(jìn)人體免疫功能的作用，特別是對(duì)治療各種癌癥有特殊療效。
目前采用從中草藥中提取有效成份，或者加入微量化學(xué)元素制成具有促進(jìn)免疫功能作用的藥物或營(yíng)養(yǎng)品的方法已有很多研究。也有從菌絲體中提取有效成份制成藥物或保健飲料劑的方法，例如從香蕈的擔(dān)子菌絲體中提取藥效成份。
本發(fā)明的目的是培養(yǎng)一種毛霉屬的新菌種，采用這一菌種與微量化學(xué)元素和中草藥提取液加工溶和，從生長(zhǎng)出的菌絲體中提取出一種具有促進(jìn)人體免疫功能的物質(zhì)-“中華808”，對(duì)治療各種癌癥、腫瘤均有特殊療效。
本發(fā)明的特征是將載有以中草藥提取液、蛋白胨、葡萄糖、化學(xué)元素、氯化鈉、瓊脂組成的CCD培養(yǎng)基的平面培養(yǎng)器放在土壤深處自然生長(zhǎng)后，分離篩選出一種新的毛霉菌株，菌名為Mucor Zona-tus milko。經(jīng)Ⅰ、Ⅱ級(jí)菌種液培養(yǎng)后將該毛霉菌的孢子接種于CCD培養(yǎng)基上，待菌絲豐滿時(shí)挑出經(jīng)水洗、過濾、冰凍后磨碎，可采用多種方法分離提取出黃色或白色晶體，即得中華808。
本發(fā)明的要點(diǎn)是菌種的培養(yǎng)、篩選將中草藥提取液20-40%，蛋白胨3-6%，葡萄糖5-10%，化學(xué)元素溶液3-6%，氯化鈉3-6%，瓊脂5-10%，補(bǔ)足蒸餾水，將pH值調(diào)至5-6.8，高壓120℃滅菌30分鐘，組成CCD培養(yǎng)基，將CCD培養(yǎng)基平面培養(yǎng)器放于深一米，寬一米，長(zhǎng)二米的土壤坑中，坑面上蓋上薄膜，薄膜上蓋上五寸高的稻草，經(jīng)8-12天培養(yǎng)，土壤中的各種微生物孢子在培養(yǎng)基上自然生長(zhǎng)出，經(jīng)分離篩選后，選出一株毛霉屬新菌種為本發(fā)明菌種，菌名Mucor Zonatus milko，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC NO.0151。
本發(fā)明采用的菌種的菌絲體在培養(yǎng)基(PDA，SMA)上生長(zhǎng)很快，分枝繁茂，形成菌落起初淺褐灰色，老后顏色變深，褐灰色;孢囊梗直立，由菌絲體直接生出，假軸狀分枝，直徑7.5-17.5微米，頂端生有孢子囊;孢子囊成熟時(shí)球形、褐色，直徑(45.0-)65.0-82.5微米，孢囊壁易破碎消失，留有囊領(lǐng)，孢子囊內(nèi)具有囊軸;囊軸梨形、寬卵形或近球形、25.0-55.0×22.5-47.5微米;孢囊孢子橢園形，長(zhǎng)卵形或近球形，(3.7)5.0-7.5×3.7-6.2微米。
異宗配合，接合孢子未見。
中草藥提取液的制作方法是，將龍英、三棱、麥冬、莪術(shù)、豬苓、法半夏、當(dāng)歸、蒲公英、金銀花、茯苓、半支蓮、山豆根、木香、菊花、海藻、昆布、扁豆、冬凌草、白花蛇舌草、夏枯草、仙鶴草、貝母等草藥每位各20克左右，碾成細(xì)粉末狀，加水1-3倍燒開，放入罐中浸泡發(fā)酵，保持溫度50℃，時(shí)間3-5天，嗅到香曲味后將罐中曲藥物取出，加一倍蒸餾水拌勻，用四層紗布?jí)簽V，將濾后的液體濃縮成稀糊狀，高壓120℃滅菌后備用。
化學(xué)元素的用量和配方是鈣、鎂、鐵、銅、鋅、硫、磷、錳、鉀、碳、鋇、釩、硒和硅各用量0.3-2克，鈦和鍶各用量0.3克，鋰0.4-0.8克，鈷0.03-0.05克，碘0.4-0.7克，鉬0.1-0.7克，銻0.2-0.4克，鉻0.4-0.8克，將上述用量的化學(xué)元素配合在一起，在600目的篩網(wǎng)上加工后，溶于500毫升的雙蒸餾水中，攪動(dòng)20分鐘，用四層紗布過濾，得清液，高壓120℃滅菌30分鐘后備用。
菌種液的制備Ⅰ級(jí)菌種液的制法將篩選出的菌種接種在由中草藥液20%，葡萄糖5%，氯化鈉3%，化學(xué)元素溶液3%，蛋白胨3%，瓊脂5%的斜面試管菌種培養(yǎng)基內(nèi)，補(bǔ)足水份，pH值5.8-6.4，15磅/cm2滅菌30分鐘，接種后在20-30℃溫度下，恒溫培養(yǎng)72-120小時(shí)后取出。
Ⅱ級(jí)菌種液的制法將Ⅰ級(jí)菌種液接種在由中草藥液40%，葡萄糖10%，氯化鈉6%，化學(xué)元素6%，蛋白胨6%，瓊脂10%的培養(yǎng)基內(nèi)，補(bǔ)足蒸餾水，pH值5.8-6.4，15磅/cm2滅菌30分鐘，接種后在20-30℃溫度下，恒溫培養(yǎng)48-64小時(shí)后取出。
毛霉菌的培養(yǎng)將上述方法培養(yǎng)出的毛霉菌的孢子接種在CCD培養(yǎng)基上，可接種于斜面試管或平面培養(yǎng)器中，或在無菌間內(nèi)大面積培養(yǎng)。無論以何種方式培養(yǎng)，均要保持充足的氧氣和一定的濕度，溫度保持在20-30℃，經(jīng)10天左右菌絲即可長(zhǎng)豐滿，此時(shí)將菌絲挑出，用5-10%的生理鹽水洗凈培養(yǎng)基的雜質(zhì)，在0℃以下用三層紗布過濾后，將干凈菌絲放在冰箱或冰庫中冷凍。
毛霉菌中有效成分的提取和分離方法將冰凍的菌絲磨碎后通常采用溶媒淬取法，或鹽析法或離子交換法提取和分離其有效成份。當(dāng)采用溶媒淬取法時(shí)，所用溶劑可以是有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇，氯仿，丙酮等，最好使用乙醇三次淬取。分離提取后的成品為黃色或白色晶體，加入防腐劑后放入冰箱保存?zhèn)溆谩?br> “中華808”的制作方法取10克上述黃色或白色晶體，將其溶于200毫升蒸餾水即成為口服劑。采用常規(guī)方法可以做成針劑或片劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是采用該方法從真菌菌絲中提取的有效物質(zhì)“中華808”，對(duì)治療各種癌癥，特別是肝癌、各種腫瘤，提高免疫功能有特殊效果，有效率達(dá)98%，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)無副作用。用量口服劑成人12ml/日，三次/日，兒童減半。
實(shí)施例1.CCD培養(yǎng)基的制作中草藥液80克，蛋白胨15克，葡萄糖20克，氯化鈉10克，化學(xué)元素12克，瓊脂10克，蒸餾水53克，將pH調(diào)至5，15磅/cm2，120℃滅菌30分鐘。
其中中草藥液的制作取龍英、三棱、麥冬、莪術(shù)、豬苓、瓜蔞、法半夏、當(dāng)歸、蒲公英、金銀花、茯苓、半支蓮、穿心蓮、山豆根、木香、菊花、海藻、昆布、扁豆、冬凌草、白花蛇舌草、夏枯草、仙鶴草、貝母24位草藥各20克，共碾成粉末，加二倍自來水燒開，放入罐中浸泡發(fā)酵，溫度50℃，時(shí)間4天，嗅到香曲味后取出，加一倍蒸餾水拌勻，用四層紗布?jí)簽V，得出液體，濃縮成稀糊狀，高壓120℃滅菌后備用。
化學(xué)元素的配方和制作鈣0.6克，鎂0.6克，鋰0.4克，鈦0.3克，鐵0.6克，鈷0.03克，銅0.4克，鋅0.7克，硫0.6克，磷0.5克，碘0.7克，鉬0.1克，錳0.6克，鉀0.7克，銻0.2克，鉻0.4克，碳0.4克，鋇0.2克，釩0.2克，鍶0.3克，硒0.4克，硅0.4克，將上述化學(xué)元素配合在一起，在600目的篩網(wǎng)上加工后，加入500毫升的雙蒸餾水中，用玻璃棒不停地?cái)噭?dòng)20分鐘，用四層紗布過濾，所得清液高壓120℃滅菌30分鐘備用。
2.將載有CCD培養(yǎng)基的平面培養(yǎng)器放入深一米，寬一米，長(zhǎng)二米的土坑中，坑面上蓋有塑料薄膜，其上蓋有五寸厚的稻草。經(jīng)10天左右，土壤中的各種微生物孢子在培養(yǎng)基上自然生長(zhǎng)，經(jīng)分離篩選出本發(fā)明菌種。
3.Ⅰ級(jí)菌種的制備將篩選出的菌種接種在由中草藥液20克、葡萄糖5克、氯化鈉3克、化學(xué)元素溶液3克、蛋白胨3克、瓊脂5克組成的菌種培養(yǎng)基內(nèi)，可使用斜面試管。補(bǔ)充61克蒸餾水，pH為6。在15磅/cm2力下滅菌30分鐘，然后在25℃下恒溫培養(yǎng)四天后取出。
4.Ⅱ級(jí)菌種液的制備將Ⅰ級(jí)菌種液接種在由中草藥液40克，葡萄糖10克，氯化鈉6克，化學(xué)元素溶液6克，蛋白胨6克，瓊脂10克的培養(yǎng)基內(nèi)，可使用三角燒瓶。補(bǔ)充22克蒸餾水，pH為6。在15磅/cm2下滅菌30分鐘，然后在25℃下恒溫培養(yǎng)二天后取出。
5.毛霉菌的培養(yǎng)將上述方法培養(yǎng)出的毛霉菌的孢子在斜面試管中接種在CCD培養(yǎng)基上，保持充足的氧氣和一定的濕度，保持溫度在25℃左右，經(jīng)10天時(shí)間菌絲即已長(zhǎng)豐滿。將菌絲挑出用9%的生理鹽水洗凈，在0℃下用三層紗布過濾，將干凈菌絲放入冰箱冷凍。
6.采用溶媒淬取法提取毛霉菌中的有效成份溶劑為乙醇，取100克經(jīng)磨碎的菌絲，加300毫升乙醇放在0-5℃浸泡24小時(shí)，經(jīng)三次淬取，第一次用45%的乙醇浸泡24小時(shí)，回收上清液，在上清液中加100毫升蒸餾水，在0℃下吹干去掉乙醇;第二次用55%的乙醇，浸泡24小時(shí)，回收上清液，在上清液中加100毫升蒸餾水，在0℃下吹干去掉乙醇;第三次用75%的乙醇浸泡24小時(shí)，回收上清液，在上清液中加100毫升蒸餾水，在0℃下吹干去掉乙醇。將三次回收的去掉乙醇的上清液配合在一起，在0℃下吹干濃縮，得黃色晶體，即成品。
7.將黃色晶體10克溶于200毫升的蒸餾水中即制成“中華808”口服劑。
權(quán)利要求
1.一種從真菌菌絲體中提取有效成份“中華808”的方法，其特征在于將中草藥提取液20-40%，蛋白胨3-6%，葡萄糖5-10%，化學(xué)元素3-6%，氯化鈉3-6%，瓊脂5-10%，補(bǔ)足蒸餾水，將PH值調(diào)至5-6.8，高壓120℃滅菌30分鐘，組成CCD培養(yǎng)基；將CCD培養(yǎng)基平面培養(yǎng)器放于土壤深處自然生長(zhǎng)8-12天后取出，經(jīng)分離篩選，培養(yǎng)出一種新菌株，菌名為Mucor zonatus milko，毛霉屬的一個(gè)種，現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC NO.0151；經(jīng)Ⅰ、Ⅱ級(jí)菌種液培養(yǎng)后將該毛霉菌的孢子在斜面試管或平面培養(yǎng)器中接種于CCD培養(yǎng)基，也可在無菌間內(nèi)大面積培養(yǎng)，待菌絲體長(zhǎng)豐滿時(shí)，立即將菌絲挑出，用5-10%的生理鹽水洗凈、過濾、冰凍后磨碎，采用溶媒淬取法、鹽析法或離子交換法等方法分離提取，濃縮成黃色或白色晶體，即得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從真菌菌絲體中提取有效成份“中華808”的方法，其特征在于，所說的中草藥提取液為龍英、三棱、麥冬、莪術(shù)、豬苓、瓜蔞、法半夏、當(dāng)歸、蒲公英、金銀花、茯苓、半支蓮、穿心蓮、山豆根、木香、菊花、海藻、昆布、扁豆、冬凌草、白花蛇舌草、夏枯草、仙鶴草、貝母等草藥每位各20克，碾成細(xì)粉末狀，加水1-3倍燒開，放入罐中浸泡發(fā)酵，保持溫度50℃，發(fā)酵3-5天，嗅到香曲味后將罐中曲藥物取出，加一倍蒸餾水拌勻，用紗布?jí)簽V，將濾后的液體濃縮成稀糊狀，高壓120℃滅菌后備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從真菌菌絲體中提取有效成份“中華808”的方法，其特征在于，所說的化學(xué)元素的用量和配方如下鈣、鎂、鐵、銅、鋅、硫、磷、錳、鉀、碳、鋇、釩、硒、硅各用量0.3-2克，鋰0.4克，鈷0.03克，碘0.7克，鉬0.1-0.7克，銻0.2克，鉻0.4-0.8克，鈦、鍶各0.3克，將上述用量的化學(xué)元素配合在一起，在600目的篩網(wǎng)上加工后，溶于500毫升的雙蒸餾水中，攪動(dòng)20分鐘，用紗布過濾得清液，高壓120℃滅菌30分鐘后備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從真菌菌絲體中提取有效成份“中華808”的方法，其特征在于所說的Ⅰ級(jí)菌種培養(yǎng)基配方中草藥液20%、葡萄糖5%、氯化鈉3%、化學(xué)元素溶液3%、蛋白胨3%、瓊脂5%，將篩選出的菌種在斜面試管中接種于上述培養(yǎng)基內(nèi)，補(bǔ)足蒸餾水將PH值調(diào)至5.8-6.4，高壓滅菌30分鐘，然后在20-30℃溫度下恒度下恒溫培養(yǎng)72-120小時(shí);Ⅱ級(jí)菌種液培養(yǎng)基配方中草藥液40%、葡萄糖10%、氯化鈉6%、化學(xué)元素溶液6%、蛋白胨6%、瓊脂10%，將Ⅰ級(jí)菌種液接種在上述培養(yǎng)基內(nèi)，補(bǔ)足蒸餾水，pH值5.8-6.4，高壓滅菌30分鐘，然后在20-30℃溫度下恒溫培養(yǎng)48-64小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從真菌菌絲體中提取有效成份“中華808”的方法，其特征在于，當(dāng)采用溶媒淬取法提取有效成份時(shí)，所用的溶劑最好是乙醇，將磨碎的菌絲加三倍的乙醇放在-5℃浸泡24小時(shí)，經(jīng)三次淬取，將每次去掉乙醇回收的上清液配合在一起，在0℃以下吹干濃縮，得黃色或白色晶體為成品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的從真菌菌絲體中提取有效成份“中華808”的方法，其特征在于，第一次淬取乙醇用量為40-50%，第二次淬取乙醇用量50-60%，第三次淬取乙醇用量為70-80%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從真菌菌絲中提取有效成份“中華808”的方法，其特征在于，用于治療各種癌癥、腫瘤的成品可以做成口服劑、針劑或片劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從真菌菌絲體中提取有效成分“中華808”的方法。采用經(jīng)分離、培養(yǎng)后命名為Mucor Zonatus milko的毛霉菌，以中草藥液、化學(xué)元素、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉組成培養(yǎng)基，經(jīng)發(fā)酵、過濾、濃縮，提取出一種白色或黃色晶體，可以根據(jù)需要做成口服劑、針劑或片劑。該有效成分對(duì)治療各種癌癥，特別是肝癌、各種腫瘤，提高免疫功能有特殊效果，有效率達(dá)98％，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)無副作用。
文檔編號(hào)C12P1/02GK1049867SQ9010151
公開日1991年3月13日 申請(qǐng)日期1990年3月22日 優(yōu)先權(quán)日1990年3月22日
發(fā)明者周發(fā)祥 申請(qǐng)人:周發(fā)祥