一種快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法。
【背景技術(shù)】
[0002]屋頂綠化因其具有增加綠化空間、隔熱保溫、降溫除塵、凈化空氣、美化景觀、節(jié)能節(jié)水等功能而成為當(dāng)今社會(huì)構(gòu)建立體空間綠化的一個(gè)重要發(fā)展研究方向。屋頂綠化工程一個(gè)重要的元素是發(fā)掘、培育具有優(yōu)良特性的綠化材料。目前植物育種方法包括有傳統(tǒng)的雜交、引種馴化、芽變、理化誘變、基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的分子育種等。各種育種方法有其優(yōu)缺點(diǎn):傳統(tǒng)的雜交育種是常用方法，已取得了輝煌的成就，但常規(guī)的優(yōu)良雜交組合選育技術(shù)周期長(zhǎng)、效率低，對(duì)后代的表型預(yù)見(jiàn)性較差；常規(guī)的理化誘變育種手段雖也在培育植物優(yōu)質(zhì)品種中起了很重要的作用，但由于該方法屬于一次性的誘變，處理繁瑣且育種周期長(zhǎng)，有益突變頻率較低，而且理化誘變一般只針對(duì)材料生長(zhǎng)的某一階段，而植物材料在不同生長(zhǎng)階段的誘變效果不同，這一點(diǎn)也導(dǎo)致了理化誘變產(chǎn)生的突變性狀比較單一、近年來(lái)培育新品種的數(shù)量逐漸減少，而且該方法也是不可能準(zhǔn)確地對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行操作和選擇，對(duì)后代的表現(xiàn)預(yù)見(jiàn)性也差；而建立在以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)技術(shù)方法為手段的基因工程就是將不同來(lái)源的基因，按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建重組基因，然后導(dǎo)入細(xì)胞，以改變生物體原有的遺傳特性，經(jīng)過(guò)田間實(shí)驗(yàn)與大田選擇育成具有理想性狀的轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源?；蚬こ逃N可對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行定向改造，較常規(guī)育種周期短，對(duì)于具有顯性性狀(正調(diào)控)的基因(如抗除草劑，抗蟲(chóng)等)采用超表達(dá)的方式；而對(duì)于負(fù)調(diào)控的植物內(nèi)源基因一般采用反義或RNAi的方法。無(wú)疑地，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是目前農(nóng)業(yè)高技術(shù)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)的熱點(diǎn)，已有一些通過(guò)分子育種技術(shù)培育植物新品種的方法受到了專(zhuān)利的保護(hù)。
[0003]佛甲草(Sedum lineare Thunb.)為莖葉多楽植物，四季常綠，耐旱、寒、瘠能力強(qiáng)，是目前各大城市屋頂綠化的主要新型綠化植物。因此，開(kāi)發(fā)育種技術(shù)以培育具有優(yōu)質(zhì)性狀的佛甲草新品種具有重要的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)意義。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于佛甲草的分子育種、再生植株培育的技術(shù)等尚未見(jiàn)有專(zhuān)利文獻(xiàn)和其它文獻(xiàn)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外佛甲草的遺傳轉(zhuǎn)化育種、再生植株培育技術(shù)方面的空白，提供了一種快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，能夠在9周內(nèi)獲得大量的具有優(yōu)良性狀的佛甲草新品種，滿足目前對(duì)佛甲草優(yōu)良株系培育技術(shù)的迫切需要，在佛甲草可持續(xù)發(fā)展中具有顯著的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益意義。
[0005]本發(fā)明的快速獲得大量轉(zhuǎn)基因佛甲草新品種的分子育種方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]a、無(wú)菌苗及外植體的獲得:取佛甲草幼嫩枝條，消毒后，將枝條分切成有一個(gè)節(jié)的切段，后逐個(gè)接種到1/2MS培養(yǎng)基，置于溫度25±1°C，光照度50μπιΟ1 πιΛΛ光照12h/天條件下培養(yǎng)，葉腋伸長(zhǎng)發(fā)育為枝，接觸培養(yǎng)基處的切口長(zhǎng)出不定根，將芽枝切出轉(zhuǎn)接入1/2MS培養(yǎng)基相同條件下進(jìn)行繼代增殖，增殖得到的芽枝即為無(wú)菌苗，從無(wú)菌苗分別切取葉片、葉柄、莖節(jié)作為外植體；
[0007]b、將步驟a制備的外植體浸泡于含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌液中，該植物表達(dá)載體含有篩選標(biāo)記基因，然后取出外植體，吸干多余的菌液后將外植體移至共培養(yǎng)基中，置25土 1°C，黑暗下培養(yǎng)，然后取出共培養(yǎng)后的外植體，漂洗后吸干外植體上殘余水分，將外植體移至抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中，置25 ± I °C，光下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出抗性芽后，將其轉(zhuǎn)接至抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)接至抗性芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，置25 土 1°C，光下培養(yǎng)，抗性芽伸長(zhǎng)并產(chǎn)生不定根，獲得抗性植株；
[0008]所述的共培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基添加Img I 1BAJ.1mg I 1NAA和20mg I 1乙酰丁香酮，pH 為 5.5 ;
[0009]C、轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè):利用植物表達(dá)載體上的篩選標(biāo)記基因、報(bào)告基因或者目標(biāo)基因的序列進(jìn)行PCR分子檢測(cè)法、Southern雜交方法或者RT-PCR檢測(cè)法，檢測(cè)抗性芽或者抗性植株是否已是轉(zhuǎn)基因材料；
[0010]d、轉(zhuǎn)基因植株的移栽:將檢測(cè)含有目標(biāo)基因的生根的轉(zhuǎn)基因植株從培養(yǎng)瓶中移出，洗去根部培養(yǎng)基，定植在裝有栽培基質(zhì)的盆中，得到移栽成功的轉(zhuǎn)基因植株。
[0011]所述的步驟b的含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體為含有目標(biāo)基因的PCAMBIA1301載體，其篩選標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶篩選基因，所述的步驟b的抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中添加Img I1BAjlmg I1NAAUOmg I 1潮霉素和500mg I 1頭孢霉素，pH為5.8 ;所述的步驟b的抗性芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加1mg I 1潮霉素和250mg I 1頭孢霉素，pH為5.8。
[0012]所述的步驟b的含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體為含有目標(biāo)基因的PCAMBIA3301載體，其篩選標(biāo)記基因?yàn)椴莅妨卓剐曰颍龅牟襟Eb的抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加Img I 1BAj.1mg I 1NAAjmg I 1草胺磷和500mg I 1頭孢霉素，pH為5.8 ;所述的步驟b的抗性芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加5mg I 1草胺磷和250mg I
孢霉素，pH為5.8。
[0013]所述的步驟b的含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體為含有目標(biāo)基因的pBI121載體，其篩選標(biāo)記基因?yàn)榭敲顾乜剐曰?；所述的步驟b的抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加Img I 1BAj.1mg I 1NAAUOOmg I 1卡那霉素和500mg I 1頭孢霉素，pH為5.8 ;所述的步驟b的抗性芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加10mg I 1卡那霉素和250mg I 1頭孢霉素，pH為5.8。
[0014]所述的含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌是通過(guò)以下方法構(gòu)建的:將目標(biāo)基因插入表達(dá)載體啟動(dòng)子之后，通過(guò)凍融法將構(gòu)建好的攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，經(jīng)抗性篩選，獲得含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌。
[0015]所述的步驟a的消毒，是將佛甲草幼嫩枝條用自來(lái)水沖洗干凈后，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的多菌靈溶液中浸泡5-10分鐘，然后取出用自來(lái)水沖洗干凈，再用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡30秒，無(wú)菌水沖洗3遍后，將枝條移入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%次氯酸鈉溶液消毒10分鐘，用無(wú)菌水沖洗6遍。
[0016]所述的步驟b的漂洗，是用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05 %吐溫80的無(wú)菌水沖洗5?6次，然后用含有500mg I 1頭孢霉素的無(wú)菌水沖洗一次。
[0017]所述的步驟d的栽培基質(zhì)為蛭石。
[0018]所述的b步驟中將外植體浸泡于含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌中的步驟是先將含有攜帶目標(biāo)基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌懸浮在含有20mg/l乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基中，其pH為5.2，常規(guī)培養(yǎng)至0D6。。= 0.4?0.5，然后將外植體浸泡于該根癌農(nóng)桿菌菌液中，時(shí)間為lOmin。
[0019]所述的MS培養(yǎng)基為國(guó)際通用的培養(yǎng)基，其成份和配置方法見(jiàn)Murashige T, SkoogF(1962)(A revised medium for rapid growth and b1assay with tobacco tissuecultures.Phys1l Plantl5:473 - 497)。所述的1/2MS培養(yǎng)基是指將MS培養(yǎng)基中的所有