利用ube3基因構(gòu)建核苷酸分子式鑒定植物品種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定植物品種的方法。本發(fā)明提供了鑒定紫薇品種的方法，包括如下步驟：1)以待測(cè)紫薇的基因組DNA為模板，用由序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；2)將所述PCR產(chǎn)物測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果列出所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式；3)將步驟2)所得的核苷酸分子式與對(duì)應(yīng)的若干個(gè)紫薇品種的核苷酸分子式進(jìn)行比對(duì)，從而確定所述待測(cè)紫薇的品種。實(shí)驗(yàn)證明，該方法精確、操作簡(jiǎn)捷，可以提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)效率和質(zhì)量監(jiān)控水平，有效彌補(bǔ)以往方法的不足；另外，該方法同時(shí)實(shí)現(xiàn)了非花期(如苗期)的鑒定。本方法對(duì)于促進(jìn)紫薇的新品種選育、紫薇花木產(chǎn)業(yè)與城市園林綠化事業(yè)的發(fā)展以及環(huán)境保護(hù)具有重要意義。
【專利說(shuō)明】利用UBE3基因構(gòu)建核苷酸分子式鑒定植物品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種鑒定或輔助鑒定植物品種的方法，特別涉及 一種利用泛素連接酶基因 （Nuclear DNA E3 ubiquitin ligase gene, UBE3)構(gòu)建核苷酸分 子式鑒定植物品種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物品種是指經(jīng)過(guò)人工選育而形成的種性基本一致、遺傳性比較穩(wěn)定、具有人類 需要的某些經(jīng)濟(jì)性狀：如觀賞性狀、藥用性狀或其它經(jīng)濟(jì)性狀，作為特殊生產(chǎn)資料用的栽培 植物群體。如牡丹品種、核桃品種、蘋(píng)果品種、紫薇品種等。
[0003] 植物品種一般利用表型性狀進(jìn)行鑒定和識(shí)別。但是，植物品種在特征表現(xiàn)上存在 季節(jié)差異，在有的季節(jié)可能表現(xiàn)不出品種間有差異的性狀。例如，紫薇品種通常按照花型和 花色進(jìn)行分類，花期以外的時(shí)間存在品種鑒定難的問(wèn)題。
[0004] 品種的準(zhǔn)確鑒定和純度分析一直是經(jīng)濟(jì)植物和資源植物（如花卉）產(chǎn)業(yè)發(fā)展上的 重要課題。在規(guī)模化生產(chǎn)領(lǐng)域，以某種具體植物品種為生產(chǎn)資料和/或產(chǎn)品進(jìn)行大規(guī)模生 產(chǎn)的企業(yè)等，需要借助靈敏度高的DNA分子分形檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行精確鑒定和分析。
[0005] 紫薇（Lagerstroemia indica L.)又名百日紅、滿堂紅等，為千屈菜科 (Lythraceae)紫薇屬的灌木或喬木，是中國(guó)有名的盛夏觀賞花木。紫薇的葉能吸附空氣中 的煙塵，是優(yōu)良的環(huán)保樹(shù)種，在城市園林綠化和荒山綠化中應(yīng)用前景廣闊。
[0006] 全世界紫薇栽培品種約500多個(gè)，以美國(guó)、中國(guó)及日本的品種最多，其中美國(guó)有 200多個(gè)品種，中國(guó)有100多個(gè)品種，日本有80多個(gè)品種。紫薇在中國(guó)已有1500多年的栽 培歷史，唐代就已經(jīng)盛栽紫薇作為觀賞花木。目前，紫薇在北京、天津、上海、重慶、廣東、海 南、廣西、福建、湖南、湖北、四川、云南、浙江、山東、陜西、吉林及香港、澳門(mén)、臺(tái)灣均有生長(zhǎng) 或栽培。紫薇種質(zhì)資源的精確鑒定對(duì)于新品種培育、生理學(xué)、生態(tài)學(xué)等眾多領(lǐng)域開(kāi)展科學(xué)研 究以及對(duì)推動(dòng)紫薇在園林綠化中的應(yīng)用是至關(guān)重要的基礎(chǔ)工作。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)紫薇品種的方法。
[0008] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)紫薇品種的方法，是利用泛素連接酶基 因序列中的變異位點(diǎn)構(gòu)建核苷酸分子式進(jìn)而鑒定或輔助鑒定待測(cè)紫薇品種的方法，具體包 括如下步驟：
[0009] (1)以待測(cè)紫薇的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單 鏈DNA分子組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；
[0010] (2)將所述PCR產(chǎn)物測(cè)序后截掉所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列自5'末端起的前76 個(gè)核苷酸（所述76個(gè)核苷酸為PCR產(chǎn)物5'端的保守序列；當(dāng)然也可以同時(shí)截掉PCR產(chǎn)物 3'端的保守序列），剩余序列作為待比對(duì)序列（非保守區(qū)）；
[0011] (3)將所述待比對(duì)序列與DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的全部序列放在一起，利用ClustalX 或Mega等軟件進(jìn)行比對(duì)，自動(dòng)生成一個(gè)DNA比對(duì)序列矩陣；
[0012] 所述DNA比對(duì)序列矩陣是根據(jù)特定的計(jì)分規(guī)則，將兩個(gè)或多個(gè)序列按位置比較排 列后產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集，最大限度地反映了序列間的相似性（如圖1所示）。其中涉及到的特定 的計(jì)分規(guī)則和算法等相關(guān)常識(shí)和原理在"生物序列分析"方面的專著中均有記載。所述DNA 比對(duì)序列矩陣可直接反映在同一核苷酸位點(diǎn)上各序列之間是否存在差異，以及存在怎樣的 差異。找到核苷酸字母有差異的列在所述DNA比對(duì)序列矩陣中的位置，核準(zhǔn)該位置位于所 述DNA比對(duì)序列矩陣5'端起的位置順序編號(hào)，即確定了一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。
[0013] 所述DNA序列庫(kù)為如下（al)或（a2):
[0014] (al)由序列表中序列3和/或序列4組成；
[0015] (a2)由序列表中序列3和序列4中的至少一種，和序列5至序列10中的至少一種 組成；
[0016] 其中，序列3和序列4為長(zhǎng)度620bp的序列；序列5至序列10為長(zhǎng)度61 lbp或 614bp的序列。
[0017] (4)根據(jù)所述DNA比對(duì)序列矩陣列出所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式；
[0018] 所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式的通式為：
[0019] B152B161B173B215B221B 245B294B299B426B431B 440B462B527B551B557 ;
[0020] 在所述通式中，所述b152、所述b161、所述b 173、所述b215、所述b221、所述b245、所述b 294、 所述b299、所述b426、所述b431、所述b 44(i、所述b462、所述b527、所述b551和所述b 557，依次表示在所 述 DNA 比對(duì)序列矩陣中的第 152、161、173、215、221、245、294、299、426、431、440、462、527、 551和557個(gè)位點(diǎn)（即多態(tài)核苷酸位點(diǎn)的位置順序編號(hào)以比對(duì)序列為基礎(chǔ)進(jìn)行確定，才合 理，符合科學(xué)，否則沒(méi)有規(guī)律可循）；
[0021] 在所述通式中，每一個(gè)B為A、T、C和G中的任一種或兩種；
[0022] 當(dāng)所述待測(cè)紫薇為純合型時(shí)，在所述通式中，每一個(gè)B為A、T、C和G中的任一種， 在測(cè)序時(shí)顯示單一峰；當(dāng)所述待測(cè)紫薇為雜合型時(shí)，在所述通式中，每一個(gè)B可能為A、T、C 和G中的兩種，在測(cè)序時(shí)會(huì)得到明顯的疊加雙峰。
[0023] (5)將步驟（4)所得所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式與核苷酸分子式組I進(jìn)行比 對(duì)；
[0024] 所述核苷酸分子式組I由如下al)_a8)共8種核苷酸分子式組成：
[0025] al) Y152G161C173Y215R221G 245R294C299C426C431A 44(IA462C527A551G557 ;
[0026] a2) Y152K161Y173Y215G221G 245G294C299C426Y431R 44(IA462Y527A551G557 ;
[0027] a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C426C431A 44(IG462C527A551A557 ;
[0028] a4) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C426Y431R 44(IR462T527A551G557 ;
[0029] a5) Y152G161C173C215R221G 245G294C299C426C431R 44(IR462C527A551R557 ;
[0030] a6) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C426Y431R 44(IR462Y527A551R557 ;
[0031] a7) C152G161C173C215G221G 245G294C299C426C431G 44(IA462C527A551G557 ;
[0032] a8) C152K161Y173C215G221G 245G294C299C426Y431G 44(IA462Y527A551G557 ;
[0033] 在al) _a8)中，M表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A 和T (即所述待測(cè)紫薇的相應(yīng)位點(diǎn)為雜合型）；
[0034] (6)根據(jù)步驟（5)的比對(duì)結(jié)果，按照如下方法對(duì)所述待測(cè)紫薇進(jìn)行品種鑒定：
[0035] 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為al)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為 或候選為紫薇品種'翠盤(pán)紅粉'；
[0036] 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a2)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為 或候選為紫薇品種'紅環(huán)直枝紫'；
[0037] 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a3)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為 或候選為紫薇品種'小花雜種粉'；
[0038] 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a4)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為 或候選為紫薇品種'寶慶淡紫'；
[0039] 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a5)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為 或候選為紫薇品種'大白花'；
[0040] 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a6)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為 或候選為紫薇品種'芙蓉面'；
[0041] 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a7)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為 或候選為紫薇品種'建民粉'；
[0042] 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a8)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為 或候選為紫薇品種'多花紫云'。
[0043] 當(dāng)然，所述方法中，步驟（1)中采用的引物對(duì)不限于序列表中序列1和序列2組成 的引物對(duì)，位于保守區(qū)的其他的引物對(duì)也可以，只要能夠擴(kuò)增得到步驟（2)中的所述待比 對(duì)序列（非保守區(qū)）即可。
[0044] 再有，在所述方法中，進(jìn)行比對(duì)的所述待比對(duì)序列（非保守區(qū)），其兩端保守區(qū)序 列的去除不限于以上步驟（2)中所述，只要能夠涵蓋用于供試樣品（如紫薇品種）鑒定的 核苷酸分子式中的多態(tài)位點(diǎn)即可；相應(yīng)的，步驟（4)中通式中B的右下角的編號(hào)也會(huì)因?yàn)?5'端保守區(qū)序列取舍的多少而相應(yīng)地發(fā)生變化，但是，多態(tài)位點(diǎn)之間的相對(duì)位置不變。
[0045] 進(jìn)一步，以上本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)紫薇品種的方法，其操作步驟 可轉(zhuǎn)化為如下 ：
[0046] (1)以待測(cè)紫薇的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單 鏈DNA分子組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；
[0047] (2)將所述PCR產(chǎn)物測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與核苷酸序列組I進(jìn)行比對(duì)；
[0048] 所述核苷酸序列組I由序列表中序列3-10共8個(gè)序列組成；
[0049] (3)根據(jù)步驟（2)的比對(duì)結(jié)果，按照如下方法對(duì)所述待測(cè)紫薇進(jìn)行鑒定：
[0050] 若所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列3,則所述待測(cè)紫薇為或候選為紫薇品 種'寶慶淡紫'；
[0051] 若所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列4,則所述待測(cè)紫薇為或候選為紫薇品 種'芙蓉面'；
[0052] 若所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列5,則所述待測(cè)紫薇為或候選為紫薇品 種'翠盤(pán)紅粉'；
[0053] 若所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列6,則所述待測(cè)紫薇為或候選為紫薇品 種'小花雜種粉'；
[0054] 若所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列7,則所述待測(cè)紫薇為或候選為紫薇品 種'大白花'；
[0055] 若所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列8,則所述待測(cè)紫薇為或候選為紫薇品 種'多花紫云'；
[0056] 若所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列9,則所述待測(cè)紫薇為或候選為紫薇品 種'紅環(huán)直枝紫'；
[0057] 若所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列中含有序列10,則所述待測(cè)紫薇為或候選為紫薇品 種'建民粉'。
[0058] 在上述方法中，所述待測(cè)紫薇為如下8個(gè)品種中的任一種：'寶慶淡紫'、'芙蓉 面'、'翠盤(pán)紅粉'、'小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫云'、'紅環(huán)直枝紫'、'建民粉'。
[0059] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)紫薇品種的試劑盒。
[0060] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)紫薇品種的試劑盒，具體可包括引物 對(duì)、記載有核苷酸分子式組I的對(duì)比卡；
[0061] 所述引物對(duì)具體由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；
[0062] 所述核苷酸分子式組I具體由如下al)_a8)共8種核苷酸分子式組成：
[0063] al) Y152G161C173Y215R221G 245R294C299C426C431A 44(IA462C527A551G557 ;
[0064] a2) Y152K161Y173Y215G221G 245G294C299C426Y431R 44(IA462Y527A551G557 ;
[0065] a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C4 26^431-^-440^462^527-^-551-^-557 ?
[0066] a4) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C4 26^431^440^462^527-^-551^557 ；
[0067] a5) Y152G161C173C215R221G 245G294C299C4 26^431^440^462^527-^-551^557 ?
[0068] a6) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C 426^431^440^462^527-^-551^557 ?
[0069] a7) C152G161C173C215G221G 245G294C299C4 26〇431〇44〇Α462〇527Α5516557 ;
[0070] a8) C152K161Y173C215G221G 245G294C299C426Y431G 44(IA462Y527A551G557 ;
[0071] 在al)_a8)中，M表示A和C;K表示G和T ;Y表示T和C;R表示A和G;W表示A 和T (即所述待測(cè)紫薇的相應(yīng)位點(diǎn)為雜合型）；
[0072] 所述待測(cè)紫薇可為如下8個(gè)品種中的任一種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤(pán)紅粉'、 '小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫云'、'紅環(huán)直枝紫'、'建民粉'。
[0073] 所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)紫薇品種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0074] 所述待測(cè)紫薇為如下8個(gè)品種中的任一種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤(pán)紅粉'、 '小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫云'、'紅環(huán)直枝紫'、'建民粉'。
[0075] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)植物品種的方法。
[0076] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)植物品種的方法，具體可包括如下步驟：
[0077] (1)通過(guò)比對(duì)屬于同一植物的多個(gè)品種的泛素連接酶基因序列，選取所述多個(gè)品 種的泛素連接酶基因序列中存在單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的區(qū)域作為目的DNA區(qū)域；
[0078] (2)利用所述目的DNA區(qū)域兩側(cè)保守區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增得到含有所述目 的DNA區(qū)域的DNA片段的引物；
[0079] (3)用所述引物對(duì)所述多個(gè)品種中的每個(gè)品種的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從 每個(gè)品種中得到含有所述目的DNA區(qū)域的DNA片段；
[0080] (4)對(duì)步驟（3)從每個(gè)品種中獲得的含有所述目的DNA區(qū)域的DNA片段進(jìn)行測(cè)序， 從而獲得每個(gè)品種的所述目的DNA區(qū)域的核苷酸序列；
[0081] (5)將所述多個(gè)品種的所述目的DNA區(qū)域的核苷酸序列放在一起進(jìn)行比對(duì)，得到 DNA比對(duì)序列矩陣，根據(jù)所述DNA比對(duì)序列矩陣確定單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，列出每個(gè)品種的鑒 定用核苷酸分子式；
[0082] 所述核苷酸分子式由根據(jù)所述DNA比對(duì)序列矩陣從5'末端到3'末端或從3'末 端到5'末端依次列出所有的所述單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的核苷酸種類及其在所述DNA比對(duì)序 列矩陣中的位置順序編號(hào)組成；所述核苷酸分子式通式為Bx1Bx2Bx3……B xn，通式中，B為單核 苷酸多態(tài)位點(diǎn)上的核苷酸種類，為A、T、C、G四種中的任一種或兩種；xl為第1個(gè)單核苷酸多 態(tài)位點(diǎn)在所述DNA比對(duì)序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編號(hào)， x2為第2個(gè)單 核苷酸多態(tài)位點(diǎn)在所述DNA比對(duì)序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編號(hào)，x3為 第3個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)在所述DNA比對(duì)序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編 號(hào)，類推， xn為第η個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)在所述DNA比對(duì)序列矩陣中從5'末端或3'末端起 的位置順序編號(hào)；
[0083] 所述Βχ1Βχ2Βχ3……Β χη為將所有的所述單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)按照在所述DNA比對(duì)序列 矩陣中從5'末端或3'末端起依次列出；當(dāng)然在實(shí)際操作中，區(qū)分效果相同的位點(diǎn)，可以只 保留一個(gè)，用于構(gòu)建核苷酸分子式；
[0084] (6)將具有相同所述核苷酸分子式的品種組成一個(gè)譜系，具有不同核苷酸分子式 的品種作為不同的譜系，所有譜系構(gòu)成核苷酸分子式譜系表；
[0085] 所述核苷酸分子式譜系表中，每一種核苷酸分子式對(duì)應(yīng)來(lái)自一個(gè)譜系的植物品 種；
[0086] (7)將屬于步驟⑴中所述同一植物的待測(cè)植物品種按照步驟（3)-(5)重復(fù)操作， 用所述待測(cè)植物品種替代步驟（3)-(5)中的所述每個(gè)品種，得到所述待測(cè)植物品種的核苷 酸分子式；將所述待測(cè)植物品種的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中的所有核苷 酸分子式進(jìn)行比較，按照如下方法確定所述待測(cè)植物品種的名稱及其隸屬的譜系：若所述 待測(cè)植物品種的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中的一個(gè)核苷酸分子式相同，則 所述待測(cè)植物品種為或候選為所述一個(gè)核苷酸分子式對(duì)應(yīng)的所述譜系中的任意一個(gè)品種。 [0087] 所述方法靈敏度高，適用于鑒定某一種植物的不同品種。
[0088] 在本發(fā)明中，所述植物具體為紫薇的不同品種。
[0089] 在所述方法中，所述目的DNA區(qū)域具體可來(lái)自于所述植物的基因組內(nèi)的泛素連接 酶基因區(qū)。
[0090] 在本發(fā)明中，步驟（2)中，所述引物具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條 單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；所述目的DNA區(qū)域具體來(lái)自于采用所述引物對(duì)對(duì)所述植物的 基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物。
[0091] 進(jìn)一步，所述紫薇的多個(gè)品種及其對(duì)應(yīng)的所述目的DNA區(qū)域?yàn)槿缦拢?br>
[0092] 所述紫薇的多個(gè)品種為如下8個(gè)品種中的至少兩種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠 盤(pán)紅粉'、'小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫云'、'紅環(huán)直枝紫'、'建民粉'。
[0093] 所述紫薇品種'寶慶淡紫'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列3 ;
[0094] 所述紫薇品種'芙蓉面'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列4 ;
[0095] 所述紫薇品種'翠盤(pán)紅粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列5 ;
[0096] 所述紫薇品種'小花雜種粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列6 ;
[0097] 所述紫薇品種'大白花'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列7 ;
[0098] 所述紫薇品種'多花紫云'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列8 ;
[0099] 所述紫薇品種'紅環(huán)直枝紫'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列9 ; [0100] 所述紫薇品種'建民粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列10。
[0101] 更加具體的，所述紫薇品種'翠盤(pán)紅粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為Y152G 161 C173Y215R221G245R294C299C426C431A440A462C527A551G557 ;
[0102] 所述紫薇品種'紅環(huán)直枝紫'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為Y152K 161Y173Y215G221 G245G294C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ;
[0103] 所述紫薇品種'小花雜種粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為T(mén)152G 161C173C215A221 G245G294C299C426C431A440G462C527A551A557 ;
[0104] 所述紫薇品種'寶慶淡紫'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為Y152K161Y 173C215R221G245 G294C299C426Y431R440R462T527A551G557 ;
[0105] 所述紫微品種'大白花'的所述DNA區(qū)域的核昔酸分子式為Y152G161C 173C215R221G245G2 94C299C426C431R440R462C527A551R557 ;
[0106] 所述紫微品種'芙容面'的所述DNA區(qū)域的核昔酸分子式為Y152K161Y 173C215R221G245G2 94C299C426Y431R440R462Y527A551R557 ;
[0107] 所述紫薇品種'建民粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為C152G161C 173C215G221G245G2 94C299C426C431G440A462C527A551G557 ;
[0108] 所述紫微品種'多花紫z?'的所述DNA區(qū)域的核昔酸分子式為C152K 161Y173C215G221G245 G294C299C426Y431G440A462Y527A551G557 ;
[0109] 其中，Μ表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T (即 所述待測(cè)紫薇的相應(yīng)位點(diǎn)為雜合型）。
[0110] 本發(fā)明以紫薇品種的鑒定過(guò)程為例，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的利用該分子式鑒 定植物（如紫薇）品種的方法較為精確、操作簡(jiǎn)捷，可以提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)效率和質(zhì)量監(jiān) 控水平，有效彌補(bǔ)以往方法的不足；另外，該方法同時(shí)實(shí)現(xiàn)了非花期（如苗期）的精準(zhǔn)鑒定。 本方法對(duì)于促進(jìn)紫薇的新品種選育、紫薇花木產(chǎn)業(yè)和城市園林綠化事業(yè)的發(fā)展以及環(huán)境保 護(hù)具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0111] 圖1為將8個(gè)紫薇品種的zw_UBE3序列進(jìn)行序列比對(duì)后得到的DNA比對(duì)序列矩陣 的局部示意圖。其中，數(shù)字"397"和"502"即表示相應(yīng)核苷酸位點(diǎn)在該DNA比對(duì)序列矩陣中 的位置順序編號(hào)；有*標(biāo)注的列即表示8個(gè)紫薇品種在該位點(diǎn)的核苷酸種類完全相同；-表 示相應(yīng)位點(diǎn)處核苷酸缺失。由于品種間實(shí)際測(cè)序得到的DNA序列長(zhǎng)度略有差異，比對(duì)后，有 的品種的序列內(nèi)會(huì)出現(xiàn)核苷酸位點(diǎn)缺失。
【具體實(shí)施方式】
[0112] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0113] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0114] 紫薇（Lagerstroemia indica L.)品種'翠盤(pán)紅粉'、'紅環(huán)直枝紫'、'小花雜種 粉'、'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'大白花'、'建民粉'、'多花紫云'和'紅爪深紫'的幼葉采自湖 南省邵陽(yáng)市紫薇花木研究所的紫薇品種資源圃。
[0115] 實(shí)施例1、利用核苷酸分子式鑒定紫薇品種的方法的建立及其應(yīng)用
[0116] 為了構(gòu)建能夠用于有效鑒定紫薇品種的核苷酸分子式，本發(fā)明的發(fā)明人從以下紫 薇品種系列中獲得泛素連接酶基因的一段非保守區(qū)DNA序列，并對(duì)其中的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了 統(tǒng)計(jì)分析。作為供試材料的紫薇品種共8種，具體如下：'翠盤(pán)紅粉'、'紅環(huán)直枝紫'、'小花 雜種粉'、'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'大白花'、'建民粉'和'多花紫云'。
[0117] 一、引物設(shè)計(jì)
[0118] 根據(jù)泛素連接酶基因的一段非保守區(qū)DNA序列兩端的保守區(qū)，設(shè)計(jì)如下引物：
[0119] 正向引物：5' -GTCCCCGTGATGTTTGA-3'（序列 1);
[0120] 反向引物：5 ' -GGTCCTTTGCCCGTAG-3 '（序列 2)。
[0121] 二、PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定
[0122] 以作為供試材料的8個(gè)紫薇品種的幼嫩葉片為實(shí)驗(yàn)材料，采用植物基因組DNA提 取試劑盒（中國(guó)天根生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為DP305)提取各樣品 材料的基因組DNA。以所得基因組DNA為模板，采用步驟一設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié) 果顯示，每個(gè)紫薇品種均可得到一條長(zhǎng)度為771-780bp的PCR產(chǎn)物。
[0123] 對(duì)純化后的各PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得了含有若干多態(tài)位點(diǎn)的長(zhǎng)度為620bp的DNA 序列（記為zw_UBE3)。根據(jù)供試的8個(gè)紫薇品種的測(cè)序結(jié)果，將zw_UBE3序列定義為所述 PCR產(chǎn)物的核苷酸序列自5'端起的第77-696位^20bp)或?yàn)樗鯬CR產(chǎn)物的核苷酸序列 自5'端起的第77-687位（611bp)或?yàn)樗鯬CR產(chǎn)物的核苷酸序列自5'端起的第77-690 位（614bp)。將所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列自5'端起的第77個(gè)核苷酸記為第1位，當(dāng)?shù)?468-488位的這21個(gè)核苷酸為7個(gè)GGC重復(fù)單元時(shí)，所述zw_UBE3序列為所述PCR產(chǎn)物的 核苷酸序列自5'端起的第77-696位（記為zw_UBE3序列A);當(dāng)?shù)?68-488位的這21個(gè) 核苷酸為4個(gè)GGC重復(fù)單元和9個(gè)缺失堿基位點(diǎn)時(shí)（即與上述zw_UBE3序列A相比缺失3 個(gè)GGC重復(fù)單元），所述zw_UBE3序列為所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列自5'端起的第77-687 位；當(dāng)?shù)?68-488位這21個(gè)核苷酸為5個(gè)GGC重復(fù)單元和6個(gè)缺失堿基位點(diǎn)時(shí)（即與上述 zw_UBE3序列A相比缺失2個(gè)GGC重復(fù)單元），所述zw_UBE3序列為所述PCR產(chǎn)物的核苷酸 序列自5'端起的第77-690位。（這個(gè)第468-488位的GGC重復(fù)單元屬于變異的高頻率發(fā) 生區(qū)域，未來(lái)的待測(cè)紫薇品種的測(cè)序結(jié)果中也可能出現(xiàn)較長(zhǎng)或較短的序列變化，可能會(huì)因 待測(cè)樣品的不同而略有變化，屆時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況獲得比對(duì)序列矩陣，確定后面的多態(tài)位 點(diǎn)的位置順序編號(hào)。）
[0124] 結(jié)果顯示，紫薇品種'寶慶淡紫'的zw_UBE3序列為序列表中序列3 ;
[0125] 紫薇品種'芙蓉面'的zw_UBE3序列為序列表中序列4 ;
[0126] 紫薇品種'翠盤(pán)紅粉'的zw_UBE3序列為序列表中序列5 ;
[0127] 紫薇品種'小花雜種粉'的zw_UBE3序列為序列表中序列6 ;
[0128] 紫薇品種'大白花'的zw_UBE3序列為序列表中序列7 ;
[0129] 紫薇品種'多花紫云'的zw_UBE3序列為序列表中序列8 ;
[0130] 紫薇品種'紅環(huán)直枝紫'的zw_UBE3序列為序列表中序列9 ;
[0131] 紫薇品種'建民粉'的zw_UBE3序列為序列表中序列10。
[0132] 三、序列比對(duì)
[0133] 將步驟二所得的8個(gè)紫薇品種的zw_UBE3序列進(jìn)行比對(duì)，獲得DNA比對(duì)序列矩陣 (aligned sequence matrix)。進(jìn)而獲得如表1中的紫薇品種鑒定用15個(gè)單核苷酸多態(tài)位 點(diǎn)。
[0134] 表1 8個(gè)紫薇品種的zw_UBE3序列中的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)
[0135]
【權(quán)利要求】
1. 一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)紫薇品種的方法，包括如下步驟： (1) 以待測(cè)紫薇的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈 DNA分子組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物； (2) 將所述PCR產(chǎn)物測(cè)序后，截掉所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列自5'末端起的前76個(gè)核 苷酸，剩余序列作為待比對(duì)序列； (3) 將所述待比對(duì)序列與DNA序列庫(kù)中的全部序列放在一起進(jìn)行比對(duì)，得到DNA比對(duì)序 列矩陣； 所述DNA序列庫(kù)為如下（al)或（a2): (al)由序列表中序列3和/或序列4組成； (a2)由序列表中序列3和序列4中的至少一種，和序列5至序列10中的至少一種組 成； (4) 根據(jù)所述DNA比對(duì)序列矩陣列出所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式； 所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式的通式為： B152B161B173B215B221B245B294B299B426B431B440B462B527B551B557 ; 在所述通式中，所述B152、所述B161、所述B173、所述B 215、所述B221、所述B245、所述B294、所 述B299、所述B426、所述B431、所述B44Q、所述B 462、所述B527、所述B551和所述B557，依次表示在所 述 DNA 比對(duì)序列矩陣中的第 152、161、173、215、221、245、294、299、426、431、440、462、527、 551和557個(gè)位點(diǎn)； 在所述通式中，每一個(gè)B為A、T、C和G中的任一種或兩種； (5) 將步驟（4)所得所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式與核苷酸分子式組I進(jìn)行比對(duì)； 所述核苷酸分子式組I由如下al) _a8)共8種核苷酸分子式組成： a!) Y152G161C173Y215R221G245R294C299C426C431A440A462C527A551G557; a2) Y152K161Y173Y215G221G245G294C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ; a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C426C431A 440G462C527A551A557 ; a4) Yl52Ki6lYl73C2i5R22lG245G294C299C426Y431R 440R462T527A551G557 ; a5) Y152G161C173C215R221G245G294C299C426C431R440R462C527A551R557 ; a6) Y152K161Y173C215R221G245G294C299C426Y431R440R462Y527A551R557 ; a?) Ci52G161C173C215G221G 245G294C299C426C431G 440A462C527A551G557 ; a8)。152〖161丫173。215〇221〇245〇294。299。426丫431〇44〇八462丫527八 5516557 ; 在al)-a8)中，M表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T ; (6) 根據(jù)步驟（5)的比對(duì)結(jié)果，按照如下方法對(duì)所述待測(cè)紫薇進(jìn)行品種鑒定： 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為al)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為或候 選為紫薇品種'翠盤(pán)紅粉'； 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a2)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為或候 選為紫微品種'紅環(huán)直枝紫'； 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a3)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為或候 選為紫薇品種'小花雜種粉'； 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a4)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為或候 選為紫薇品種'寶慶淡紫'； 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a5)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為或候 選為紫微品種'大白花'； 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a6)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為或候 選為紫微品種'芙容面'； 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a7)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為或候 選為紫薇品種'建民粉'； 若所述待測(cè)紫薇的核苷酸分子式為a8)所示的核苷酸分子式，則所述待測(cè)紫薇為或候 選為紫薇品種'多花紫云'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述待測(cè)紫薇為如下8個(gè)品種中的任一 種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤(pán)紅粉'、'小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫云'、'紅環(huán)直枝 紫'、'建民粉'。
3. -種用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)紫薇品種的試劑盒，包括引物對(duì)、記載有核苷酸分子 式組I的對(duì)比卡； 所述引物對(duì)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成； 所述核苷酸分子式組I由如下al) _a8)共8種核苷酸分子式組成： a!) Y152G161C173Y215R221G245R294C299C426C431A440A462C527A551G557; a2) Y152K161Y173Y215G221G245G294C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ; a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C426C431A 440G462C527A551A557 ; a4) Yl52Ki6lYl73C2i5R22lG245G294C299C426Y431R 440R462T527A551G557 ; a5) Y152G161C173C215R221G245G294C299C426C431R440R462C527A551R557 ; a6) Y152K161Y173C215R221G245G294C299C426Y431R440R462Y527A551R557 ; a?) Ci52G161C173C215G221G 245G294C299C426C431G 440A462C527A551G557 ; a8)。152〖161丫173。215〇221〇245〇294。299。426丫431〇44〇八462丫527八 5516557 ; 在al)-a8)中，M表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T ; 所述待測(cè)紫薇為如下8個(gè)品種中的任一種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤(pán)紅粉'、'小花 雜種粉'、'大白花'、'多花紫云'、'紅環(huán)直枝紫'、'建民粉'。
4. 權(quán)利要求3所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)紫薇品種中的應(yīng)用； 所述待測(cè)紫薇為如下8個(gè)品種中的任一種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤(pán)紅粉'、'小花 雜種粉'、'大白花'、'多花紫云'、'紅環(huán)直枝紫'、'建民粉'。
5. -種鑒定或輔助鑒定待測(cè)植物品種的方法，包括如下步驟： (1)通過(guò)比對(duì)屬于同一植物的多個(gè)品種的泛素連接酶基因序列，選取所述多個(gè)品種的 泛素連接酶基因序列中存在單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的區(qū)域作為目的DNA區(qū)域； ⑵利用所述目的DNA區(qū)域兩側(cè)保守區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增得到含有所述目的DNA 區(qū)域的DNA片段的引物； ⑶用所述引物對(duì)所述多個(gè)品種中的每個(gè)品種的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從每個(gè) 品種中得到含有所述目的DNA區(qū)域的DNA片段； (4) 對(duì)步驟（3)從每個(gè)品種中獲得的含有所述目的DNA區(qū)域的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，從而 獲得每個(gè)品種的所述目的DNA區(qū)域的核苷酸序列； (5) 將所述多個(gè)品種的所述目的DNA區(qū)域的核苷酸序列放在一起進(jìn)行比對(duì)，得到DNA比 對(duì)序列矩陣，根據(jù)所述DNA比對(duì)序列矩陣確定單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，列出每個(gè)品種的核苷酸 分子式； 所述核苷酸分子式由根據(jù)所述DNA比對(duì)序列矩陣從5'末端到3'末端或從3'末端到 5'末端依次列出所有的所述單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的核苷酸種類及其在所述DNA比對(duì)序列矩 陣中的位置順序編號(hào)組成；所述核苷酸分子式通式為B x1Bx2Bx3……Bxn，通式中，B為單核苷酸 多態(tài)位點(diǎn)上的核苷酸種類，為A、T、C、G四種中的任一種或兩種 ；xl為第1個(gè)單核苷酸多態(tài) 位點(diǎn)在所述DNA比對(duì)序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編號(hào)，x2為第2個(gè)單核 苷酸多態(tài)位點(diǎn)在所述DNA比對(duì)序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編號(hào)， x3為第3 個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)在所述DNA比對(duì)序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編號(hào)， 類推， xn為第η個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)在所述DNA比對(duì)序列矩陣中從5'末端或3'末端起的 位置順序編號(hào)； 所述Βχ1Βχ2Βχ3……Βχη為將所有的所述單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)按照在所述DNA比對(duì)序列矩陣 中從5'末端或3'末端起依次列出； (6) 將具有相同所述核苷酸分子式的品種組成一個(gè)譜系，具有不同核苷酸分子式的品 種為不同的譜系，所有譜系構(gòu)成核苷酸分子式譜系表； 所述核苷酸分子式譜系表中，每一種核苷酸分子式對(duì)應(yīng)來(lái)自一個(gè)譜系的植物品種； (7) 將屬于步驟（1)中所述同一植物的待測(cè)植物品種按照步驟（3)-(5)重復(fù)操作，用所 述待測(cè)植物品種替代步驟（3)-(5)中的所述每個(gè)品種，得到所述待測(cè)植物品種的核苷酸分 子式；將所述待測(cè)植物品種的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中的所有核苷酸分 子式進(jìn)行比較，按照如下方法確定所述待測(cè)植物品種的名稱及其隸屬的譜系：若所述待測(cè) 植物品種的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中的一個(gè)核苷酸分子式相同，則所述 待測(cè)植物品種為或候選為所述一個(gè)核苷酸分子式對(duì)應(yīng)的所述譜系中的任意一個(gè)品種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述植物為紫薇。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述目的DNA區(qū)域來(lái)自于所述植物 的基因組內(nèi)的泛素連接酶基因區(qū)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于： 步驟⑵中，所述引物具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組 成的引物對(duì)； 所述目的DNA區(qū)域來(lái)自于采用所述引物對(duì)對(duì)所述植物的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得 的PCR產(chǎn)物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述紫薇的多個(gè)品種及其對(duì)應(yīng) 的所述目的DNA區(qū)域?yàn)槿缦拢?所述紫薇的多個(gè)品種為如下8個(gè)品種中的至少兩種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤(pán)紅 粉'、'小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫云'、'紅環(huán)直枝紫'、'建民粉'； 所述紫薇品種'寶慶淡紫'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列3 ; 所述紫薇品種'芙蓉面'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列4 ; 所述紫薇品種'翠盤(pán)紅粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列5 ; 所述紫薇品種'小花雜種粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列6 ; 所述紫薇品種'大白花'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列7 ; 所述紫薇品種'多花紫云'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列8 ; 所述紫薇品種'紅環(huán)直枝紫'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列9 ; 所述紫薇品種'建民粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸序列為序列表中序列10。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述方法，其特征在于： 所述紫薇品種'翠盤(pán)紅粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為Y152G161C173Y 215R221G245R294C 299。426。431八44〇八462。527八551〇557 ; 所述紫薇品種'紅環(huán)直枝紫'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為Y152K161Y173Y 215G221G245G2 94C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ; 所述紫微品種'小花雜種粉'的所述DNA區(qū)域的核昔酸分子式為T(mén)152G161C173C 215A221G245G2 94C299C426C431A440G462C527A551A557 ; 所述紫薇品種'寶慶淡紫'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為Y152K161Y173C 215R221G245G294C 299C426Y431R440R462T527A551G557 ; 所述紫薇品種'大白花'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為Y152G161C173C 215R221G245G294C299 C426C431R440R462C527A551R557 ; 所述紫薇品種'芙蓉面'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為Y152K161Y173C 215R221G245G294C299 C426Y431R440R462Y527A551R557 ; 所述紫薇品種'建民粉'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為C152G161C173C 215G221G245G294C299 C426C431G440A462C527A551G557 ; 所述紫薇品種'多花紫云'的所述DNA區(qū)域的核苷酸分子式為C152K161Y173C 215G221G245G294C 299^426^431^440-^462^527-^551^557 ； 其中，Μ表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104195243SQ201410418156
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】索志立, 黃建民, 黃磊, 侯伯鑫, 林道銀 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所, 湖南省紫薇花木研究所