4 的 Mw 分別為 2. 696e+5、6. 089e+4、3. 406e+5。
[0018] 2. 2單糖組成分析 2. 2. 1多糖的水解 準(zhǔn)確稱取10 mg的BSP-2、BSP-3、BSP-4分別溶于2 mL、2 mol/L的三氟乙酸中，再轉(zhuǎn)移 到5 mL安瓿瓶中，充氮?dú)夥夤?，?10 °C下水解3 h，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸溶液，殘 余物中加入少量甲醇溶解，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到干，如此反復(fù)3次，得到水解產(chǎn)物備用。
[0019] 2. 2. 2單糖的衍生化 向水解產(chǎn)物中依次加入10 mg鹽酸羥胺和0. 5 mL吡啶，振蕩混勻，放入90°C水浴中加 熱反應(yīng)30 min。取出后冷卻至室溫，加入0.5 mL醋酸酐，在90°C下繼續(xù)反應(yīng)30 min進(jìn)行 乙酰化，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0. 22 y m濾膜過濾后注入氣相色譜進(jìn)行分析；標(biāo)準(zhǔn)單糖用相同方法處 理，并制成標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物混合液。
[0020] 2. 2. 3氣相色譜條件 色譜柱：Thermo TG-Waxms (30 mXO. 32 mm，0. 5 ym);進(jìn)樣溫度：250°C;FID 檢測(cè)器溫 度：280°C ;色譜柱升溫程序：初始溫度100°C保持1 min，然后以4°C /min的速率由100°C 升至230°C，保持lOmin ;載氣：高純氮?dú)?，流? mL/min ;進(jìn)樣量為2 ML。
[0021 ] 2. 2. 4單糖組成分析結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的GC色譜圖見圖6,圖7、8、9分為BSP-2、BSP-3、BSP-4經(jīng)水解后的 單糖GC色譜圖，通過和標(biāo)準(zhǔn)單糖圖譜中保留時(shí)間的比較可以確定樣品的單糖組成。由圖 7可知，BSP-2至少由鼠李糖、阿拉伯糖和木糖構(gòu)成，其摩爾比為鼠李糖：阿拉伯糖：木糖 =0. 236:0. 433:0. 140,由圖8可知，BSP-3至少由鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、木糖構(gòu)成，摩爾比 為鼠李糖：果糖：阿拉伯糖：木糖=0. 203:0. 366:1. 605:0. 593，由圖9可知，BSP-4至少有 鼠李糖和阿拉伯糖構(gòu)成，其摩爾比=〇. 851:0. 733。
[0022] 3抗凝血黑莓籽多糖（BSP-2、BSP-3、BSP-4)的活性分析 方法：家兔體外血漿凝血四項(xiàng)檢測(cè) 3. 1儀器和材料 TGL-16gR高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠）；LRH-150生化培養(yǎng)箱（上海一 恒科技有限公司）；氯化鈉注射液(河北天成藥業(yè)股份有限公司，A14091701);0. 109 mol/ L枸櫞酸鈉溶液（自制)、維生素&注射液（天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，1403112); 注射用燈盞花素（湖南恒生制藥有限公司，20110202);凝血酶原時(shí)間（PT)測(cè)定試劑盒 (105241);活化部分凝血酶時(shí)間（APTT)測(cè)定試劑盒（112175);凝血酶時(shí)間（TT)測(cè)定試劑盒 (121132);纖維蛋白原（FIB)含量測(cè)定試劑盒（1320701)均由上海太陽生物技術(shù)有限公司 生產(chǎn)。
[0023] 3. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 獺兔，雄性，體重2. 0~2. 5 kg，由河南大學(xué)藥學(xué)院中藥研究所提供（醫(yī)動(dòng)字14-2-6 號(hào)）。
[0024] 3. 3樣品溶液配制 1 mg的樣品（BSP-2、BSP-3、BSP-4)用200 y L溶劑溶解制5 mg/mL溶液。取燈盞花 素8 mg用600 y L溶劑制得13. 33 mg/mL，維生素1注射液用溶劑溶解制得維生素K丨濃 度5 mg/mL的溶液。溶劑(也作為空白溶劑)為：無水乙醇：1，2-丙二醇：生理鹽水=1:1:3 (體積比)。
[0025] 3. 4實(shí)驗(yàn)方法 3. 4. 1對(duì)APTT影響的檢測(cè)方法 血漿的制備：家兔耳緣靜脈取血3. 6 mL，置于含有0. 109 mol/L枸櫞酸鈉400 y L的4 mL離心管中，輕輕顛倒混勻，3000 rpm離心15 min，取上層清液備用。
[0026] 分別在不同測(cè)試杯中加入50 y L各個(gè)樣品溶液，再加入100 y L血漿和37 °C預(yù) 溫的APm式劑100 y L，37 °C孵育5 min后加入37°C預(yù)溫的0? 025 mol/L CaCl2溶液100 y L，記錄凝固時(shí)間。
[0027] 3. 4. 2對(duì)PT影響的檢測(cè)方法 血漿制備方法同3. 4. 1，分別在不同測(cè)試杯中加入50 iiL各個(gè)樣品溶液，再加入100 y L的血漿，37°C孵育3 min后加入37°C預(yù)溫的PT試劑200 y L，記錄凝固時(shí)間，即為PT 值。
[0028] 3. 4. 3對(duì)TT影響的檢測(cè)方法 血漿制備方法同3. 4. 1，分別在不同測(cè)試杯中加入50 y L各個(gè)樣品溶液和200 y L的血 漿，孵育3min后加入TT試劑200 y L，記錄凝固時(shí)間。
[0029] 3. 4. 4對(duì)FIB影響的檢測(cè)方法 血漿制備方法同3. 4. 1，按照試劑說明書定標(biāo)準(zhǔn)曲線。取200 y L血漿和200 y L樣 品，然后加入700 yL緩沖液?；靹蚝?，取稀釋后的血漿200 yL，37°C預(yù)溫3 min，加入凝血 酶溶液100 yL，記錄纖維蛋白原的含量。
[0030] 3. 4. 5數(shù)據(jù)處理 結(jié)果采用算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)值統(tǒng)計(jì)采用SPSS19. 0軟件單因素方差分析法 (One-Way AN0VA)比較其顯著性差異。測(cè)定結(jié)果見表1。
[0031] 表1體外凝血四項(xiàng)結(jié)果
注：與空白比較 _尸< 0. 001，0. 01 < #V< 0. 05, 0. 05 ; 與維生素I比較，八八八尸< 0? 001，0? 01 <八八尸< 0? 05。
[0032] 由表1可知，BSP-2、BSP-3、BSP-4延長TT的效果與空白組相比有極顯著差異 (K0. 001 )，說明這三個(gè)多糖都有一定的抗凝血作用，且BSP-3的抗凝血效果與陽性對(duì)照燈 盞花素相當(dāng)（/M). 05)，而BSP-2和BSP-4的抗凝血效果比陽性對(duì)照燈盞花素好（代0. 001)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 抗凝血黑莓籽多糖的提取分離方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將黑莓籽粉碎，室溫下用石油醚脫脂，揮干石油醚后，藥渣用乙醇提取，過濾，陰干 殘?jiān)缓笙驓堅(jiān)屑尤胝麴s水提取，趁熱抽濾，合并濾液后減壓濃縮，再向濃縮液中加入 乙醇，靜置離心，得到的沉淀加蒸餾水溶解透析以除去小分子雜質(zhì)，減壓濃縮，冷凍干燥即 得黑莓籽粗多糖； (2) 取黑莓籽粗多糖溶于蒸餾水中，過濾，棄去雜質(zhì)后加入到DEAE-52纖維素柱色譜， 依次用蒸餾水、〇. lmol/L氯化鈉溶液和0. 2 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液采用苯 酚-硫酸法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)490 nm處的吸光度，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制 洗脫曲線，合并同一洗脫峰的多糖樣品，透析、濃縮后冷凍干燥；其中，蒸餾水洗脫峰為組分 1，0.1 mol/L氯化鈉溶液的洗脫峰為組分2,0. 2 mol/L氯化鈉溶液的洗脫峰為組分3 ; (3) 組分1溶于蒸餾水中、過濾棄去雜質(zhì)，加入到SephadexG-100凝膠柱色譜，用蒸餾 水進(jìn)行洗脫，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行檢測(cè)，在波長490 nm處測(cè)其吸光度，以洗脫管數(shù)為橫坐 標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，得到兩組洗脫峰，濃縮第2組洗脫峰，冷凍干燥得到的 多糖命名為BSP-2 ; (4) 組分2和3均采用步驟（3)組分1的方法進(jìn)行洗脫，得單一洗脫峰，分別命名為 BSP-3 和 BSP-4 ; BSP-2、BSP-3和BSP-4即為抗凝血黑莓籽多糖。2. 利用權(quán)利要求1的方法制備得到的抗凝血黑莓籽多糖。3. 權(quán)利要求2所述抗凝血黑莓籽多糖在制備抗凝血藥物方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗凝血黑莓籽多糖及其提取分離方法、應(yīng)用。該提取分離方法將黑莓籽粉碎后，用水提醇沉的方法得到粗多糖，再分別通過DEAE-52纖維素柱色譜和SephadexG-100凝膠柱色譜得到三個(gè)多糖。本發(fā)明采用特殊的提取分離方法從黑莓籽中分離得到三個(gè)多糖，并對(duì)這三個(gè)多糖的體外凝血效果進(jìn)行考察，結(jié)果表明，這三個(gè)多糖均有良好的抗凝血效果。
【IPC分類】C08B37/00, A61P7/02, A61K31/715
【公開號(hào)】CN105037578
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510529023
【發(fā)明人】康文藝, 魏金鳳, 張偉, 連朋麗, 謝平耀
【申請(qǐng)人】河南大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年8月24日