Ala-AIa_Arg_AIa
當(dāng)C末端為羧基時(shí)，選擇王樹脂進(jìn)行二種多肽的化學(xué)固相合成。合成結(jié)束后，將得到的側(cè)鏈保護(hù)基的多肽樹脂進(jìn)行裂解，NPC多肽的C末端從樹脂上斷裂下來(lái)形成羧基。
[0031]以上固相合成是在ABI公司的多肽合成儀上進(jìn)行。首先將C末端的丙氨酸連接樹月旨，然后一個(gè)一個(gè)的氨基酸從C端向N端進(jìn)行。待合成結(jié)束后，脫保護(hù)基和從樹脂上斷裂后，用反向HPLC層析(Waters公司，C18制備柱)對(duì)NPC多肽進(jìn)行純化。純化條件為A相含0.5% (V/V)乙酸的水溶液，B相為含80%乙腈和0.5% (V/V)乙酸的水溶液，0_100%B液梯度洗脫。收集目的多肽，經(jīng)凍干成干粉。經(jīng)質(zhì)譜分析，NPC多肽的分子量為3990.5道爾頓。
[0032]實(shí)例2、NPC多肽在大腸桿菌中的重組制備
根據(jù)實(shí)例I中NPC的氨基酸序列，采用大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計(jì)其cDNA序列，由大連寶生生物公司全基因人工合成。將合成的cDNA片段(插入pMB-19T質(zhì)粒中)，用BamH2和Hind III雙酶切后回收，將重組融合表達(dá)pMAL-c2X質(zhì)粒同樣雙酶切后回收大片段。在T4連接酶作用下，將NPC基因片段和pMAL-c2X連接后轉(zhuǎn)化DH5 α菌。經(jīng)平板篩選出含插入NPC基因的重組質(zhì)粒命名為pMAL-c2X-NPC。再用CaCl2法轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)中，獲及重組表達(dá)菌株，經(jīng)ImMol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生MBP-NPC的融合蛋白。該融合蛋白經(jīng)N1-S印harose層析純化后，用腸激酶酶切除去MPB (堿性髓鞘蛋白)，再用C18反相柱純化重組NPC多肽，凍干成干粉。
[0033]SEQ ID NO: 2 (NPC 的 cDNA 序列):
tgtggtggtg gtggtggtat tgaaggtcct actttgagac aatggttggc tgctagagct 60ggtggtggtg gtggtggtgg tggtattgaa ggtcctactt tgagacaatg gttggctgct 120agagct126
實(shí)例3、NPC-PEG2qk-NPC同源四聚體的制備
將平均分子量為20kD的雙馬來(lái)酰亞胺活化的聚乙二醇(mal-PEG2(]K-mal)按20.0mg/ml溶于lOOmMol/L乙酸鈉緩沖中(pH6.5)，室溫?cái)嚢钘l件下，逐漸加入NPC多肽至兩者的摩爾濃度達(dá)到mal-PEG2QK-mal:NPC為1:2~4。反應(yīng)4_12小時(shí)后，用RP-HPLC經(jīng)ELSD (蒸發(fā)光)檢測(cè)PEG偶聯(lián)二聚體達(dá)到85%以上。加入1%的TFA終止反應(yīng)，用反向C18柱純化分離除去未修飾的NPC多肽、游離mal- PEG20k-mal和單修飾物PEG2QK—NPC，純化后的NPC- PEG20k-NPC同源四聚體凍干成干粉保存。
[0034]實(shí)例4、NPC-PEG35k-NPC同源四聚體的制備
將平均分子量為35kD的雙馬來(lái)酰亞胺活化的聚乙二醇(mal-PEG35K - mal)按20.0mg/ml溶于lOOmMol/L乙酸鈉緩沖中(pH6.5)，室溫?cái)嚢钘l件下，逐漸加入NPC多肽至兩者的摩爾濃度達(dá)到mal-PEG35K - mal =NPC為1:2~4。反應(yīng)4-12小時(shí)后，用RP-HPLC經(jīng)ELSD (蒸發(fā)光)檢測(cè)PEG偶聯(lián)二聚體達(dá)到80%以上。加入1%的TFA終止反應(yīng)，用反向C18柱純化分離除去未修飾的NPC、游離mal- PEG35K-mal和單修飾物PEG35k -NPC，純化后的NPC-PEG35k-NPC同源四聚體凍干成干粉保存。
[0035]實(shí)例5、NPC-PEG40k同源二聚體的制備
將平均分子量為40kD的單馬來(lái)酰亞胺活化的聚乙二醇(mal-PEG4(]K)按20.0mg/ml溶于lOOmMol/L乙酸鈉緩沖中(pH6.5)，室溫?cái)嚢钘l件下，逐漸加入NPC多肽至兩者的摩爾濃度達(dá)到PEG40k =NPC為1:1。反應(yīng)4-12小時(shí)后，用RP-HPLC經(jīng)ELSD (蒸發(fā)光)檢測(cè)PEG偶聯(lián)達(dá)到85%以上。加入1%的TFA終止反應(yīng)，用反向C18柱純化分離除去未修飾的NPC和游離mal-PEG4(]K，純化后的NPC-PEG4idk同源二聚體凍干成干粉保存。
[0036]實(shí)例6、聚乙二醇血小板生成素模擬肽同源四聚體在正常小鼠體內(nèi)升血小板藥效作用。
取昆明小鼠，體重20-25克，每組10只，分成4組?？瞻讓?duì)照組為生理鹽水組，實(shí)驗(yàn)組為NPC、NPC-PEG35k-NPC和NPC-PEG4idk組，分別按10.0ug/kg腹腔單次注射。于給藥后第3天、第6天、第9天及第13天眼球缺血120ul，測(cè)定外周血血小板數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組血小板數(shù)量均明顯升高，其中NPC-PEG35k-NPC組第6天血小板數(shù)量升高4-5倍；NPC組(未聚乙二醇修飾)血小板數(shù)量升高水平和維持時(shí)間均低于聚乙二醇修飾組(NPC-PEG35k-NPC 和 NPC-PEG4qk 組)。
[0037]實(shí)例7、聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體在卡鉬誘發(fā)血小板減少動(dòng)物模型的升血小板藥效作用
取昆明小鼠，體重20-25克，腹腔注射卡鉬150mg/kg后分為4組，每組10只:對(duì)照組注射生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組為Nplate (Amgen生產(chǎn))，實(shí)驗(yàn)組為NPC-PEG2qk-NPC組、NPC-PEG35k-NPC組，均按25.0ug/kg腹腔單次注射。于給藥后第3天、第6天、第9天及第13天眼球取血120ul，測(cè)定外周血血小板數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組血小板數(shù)量均明顯升高，第13天NPC-PEG2ffl1-NPC組和NPC-PEG35k-NPC組血小板恢復(fù)正常。
[0038]實(shí)例8、聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體在ITP血小板減少動(dòng)物模型的升血小板藥效作用
取特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)模型小鼠，每組10只，分成4組。實(shí)驗(yàn)組為NPC-PEG20k-NPC 組、NPC-PEG35k-NPC 組及 Nplate (Amgen 生產(chǎn))組，均按 25.0ug/kg 腹腔單次注射。于給藥后第3天、第6天、第9天及第13天眼球取血120ul，測(cè)定外周血血小板數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組血小板數(shù)量均明顯升高。
[0039]實(shí)例9、聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體比格犬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)
取比格犬4只，雌雄各2只。按100 μ g/kg劑量皮下給予NPC-PEG35k-NPC后，分別于O小時(shí)、0.5小時(shí)、I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)、144小時(shí)、168小時(shí)、192小時(shí)采血0.5ml，離心分離得血清，-80°C保存。同時(shí)相應(yīng)測(cè)定相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的外周血血小板數(shù)量。采用自建的雙夾心Elisa試劑盒，測(cè)定血藥濃度并繪制藥時(shí)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NPC-PEG35k-NPC的半衰期為96小時(shí)，在單次給藥后，外周血血小板數(shù)量顯著升高，可維持7天以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體，其特征是通過(guò)血小板生成素模擬肽二聚體氨基末端的半胱氨酸殘基與雙活化的聚乙二醇偶聯(lián)而成，其中 (1)血小板生成素模擬肽二聚體(代號(hào)NPC)的序列特征為:NH2-Cys-(Gly)n-1le-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala- (Gly)m-1Ie-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala-COOH 其中η和m為5-10的整數(shù)； (2)聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體的結(jié)構(gòu)特征為NPC- (CH2-CH2) n-NPC 其中 η 為 100-1000，CH2-CH2 為乙二醇； (3)血小板生成素模擬肽二聚體(NPC)的氨基末端半胱氨酸的巰基與活化的聚乙二醇分子共價(jià)偶聯(lián)。2.權(quán)利要求1中所述的雙活化聚乙二醇分子量為10000-40000道爾頓。3.權(quán)利要求1和2中的雙活化聚乙二醇分子的活性基團(tuán)包括馬來(lái)酰亞胺活化的聚乙二醇、乙烯基砜活化的聚乙二醇、碘乙酰胺活化的聚乙二醇、吡啶二硫醚活化的聚乙二醇，優(yōu)選馬來(lái)酰亞胺活化的聚乙二醇。4.權(quán)利要求1-3中任一形式的聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體，可作為促進(jìn)血小板數(shù)量增加的藥物或藥物組合物。5.權(quán)利4中的藥物或藥物組合物適用于治療特發(fā)性血小板減少性紫癜、化療引起的血小板減少癥、肝炎引起的血小板減少綜合癥及骨髓增生異常等血小板減少癥。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有長(zhǎng)效作用的聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體的制備方法及其用途。通過(guò)氨基末端為半胱氨酸殘基的血小板生成素模擬肽二聚體與聚乙二醇分子兩端偶聯(lián)而成的聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體，具有長(zhǎng)效升高外周血血小板數(shù)量的功能，可作為一種血小板減少癥的治療藥物，包括特發(fā)性血小板減少性紫癜、化療引起的血小板減少癥、肝炎引起的血小板減少綜合癥及骨髓增生異常綜合癥等。
【IPC分類】A61K38/19, A61K47/48, C07K14/52, A61P7/04
【公開號(hào)】CN105017408
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410181486
【發(fā)明人】陳清, 范開, 陳海容
【申請(qǐng)人】重慶派金生物科技有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2014年4月30日