一種雌蠶絲蛋白多肽1及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)多肽制備領(lǐng)域，具體涉及雌蠶絲蛋白多肽制備領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 蠶絲廣泛應(yīng)用于纖維制造業(yè)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，不同性別的蠶的蠶絲蛋白其結(jié)構(gòu) 和化學(xué)性質(zhì)不同。結(jié)果顯示，雄蠶絲的結(jié)晶度、取向度、耐熱性能、斷裂強(qiáng)度都較高，但雄蠶 絲吸濕能力低于雌蠶絲，而在放濕過程中雄蠶絲達(dá)到平衡的時間要低于雌蠶絲。因此，當(dāng)蠶 絲用于纖維制造時，往往優(yōu)選雄蠶絲，而大量的雌蠶絲則被丟棄，造成了浪費。
[0003] 隨著蠶絲的應(yīng)用領(lǐng)域的拓寬，蠶絲在化妝品領(lǐng)域的功效顯得尤為突出。由于蠶絲 蛋白質(zhì)分子特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有天然調(diào)濕、改善人體皮膚營養(yǎng)、防止皮膚起皺、增強(qiáng)皮膚 細(xì)胞活力和彈性、促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝及維持皮膚正常生理狀態(tài)的作用。由于，化妝品與纖維 制造的需求不同，化妝品需要更高的保濕效果，因此，雌蠶絲比雄蠶絲具有更好的吸濕能力 和更慢的放濕過程的特點，如果應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域，有起到更好的保濕作用，能更有效的改 善皮膚營養(yǎng)，恢復(fù)細(xì)胞活力和彈性。
[0004] 當(dāng)雌蠶絲蛋白應(yīng)用于化妝品時，和普通蠶絲蛋白一樣存在分子量較大的問題。較 大的分子量的蛋白往往會引起過敏反應(yīng)，導(dǎo)致皮膚瘙癢。小分子蛋白質(zhì)或多肽就不容易誘 發(fā)免疫變態(tài)反應(yīng)。但是，小分子蛋白質(zhì)往往會失去原形蛋白質(zhì)的功效。因此，如何才能讓分 解后的蠶絲蛋白小分子既有原蛋白質(zhì)的功效，且不引起過敏，一直是一個難以協(xié)調(diào)的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的
[0006] 針對現(xiàn)有蠶絲蛋白化妝品的現(xiàn)狀，發(fā)明一種雌蠶絲蛋白多肽及制備和應(yīng)用，該多 肽是利用雌蠶絲制備的多肽，將該多肽應(yīng)用于化妝品，其與雄蠶絲蛋白和普通蠶絲蛋白相 比，具有更好的保濕效果，且該多肽沒有抗原性。
[0007] 技術(shù)方案
[0008] 一種雌蠶絲蛋白多肽，其特征在于，序列為HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG。所述雌蠶 絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟包括（1)將清洗、烘干后的雌蠶繭100g剪碎，加 入100mL去離子水中；(2)在-80°c速凍；（3)將蠶繭和水的混合物超聲、粉碎；(4)煮沸1-2 小時，同時緩慢攪拌；（5)待溶液冷卻后，加入水解酶，在20-40°C反應(yīng)30-60分鐘；(6)離心 2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清；（6)采用鹽析法，將蠶絲蛋白沉淀；（7)將沉淀物復(fù)溶于 pH5. 4-5. 7緩沖液中，脫鹽；(8)采用分子篩層析技術(shù)，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即 得。
[0009] .根據(jù)權(quán)利要求書2所述雌蠶絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟（5)中所 述的水解酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、生姜蛋白酶或合歡蛋白酶。所述雌蠶絲蛋 白多肽的制備方法，其特征在于，步驟（7)中所述的鹽析法所用的鹽為NH 4C1。
[0010] 所述雌蠶絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟（8)中所述的緩沖液為PBS。
[0011] 所述雌蠶絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟（9)中所述的分子篩為葡聚 糖凝膠。
[0012] 所述的雌蠶絲蛋白多肽在制備化妝品中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明多肽委托上海吉爾生化合成，純度為95%。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明的制備得到的雌蠶絲蛋白多肽，經(jīng)蛋白質(zhì)序列測定，序列為 HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG，純度大于70%。實驗表明，該多肽具有保濕的作用，作用與普通 蠶絲蛋白和雄蠶絲蛋白相比，效果更好?？乖瓕嶒灲Y(jié)果表明，該多肽沒有抗原性。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1
[0017] 將清洗、烘干后的雌蠶繭100g剪碎，加入100mL去離子水中；在-80°C速凍；將蠶 繭和水的混合物超聲、粉碎；煮沸1小時，同時緩慢攪拌；待溶液冷卻后，加入生姜蛋白酶， 在室溫反應(yīng)60分鐘；離心3000rpm，5-10分鐘，取上清；在上清中加入NH4C1，將蠶絲蛋白 沉淀，離心，得沉淀物；將沉淀物復(fù)溶于PH5. 4-5. 7緩沖液中，透析脫鹽；采用分子篩層析技 術(shù)，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白質(zhì)自動測序儀測定該多肽的序列 為 HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG，純度為 72. 3%。
[0018] 實施例2
[0019] 將清洗、烘干后的雌蠶繭100g剪碎，加入100mL去離子水中；在-80°C速凍；將蠶 繭和水的混合物超聲、粉碎；煮沸2小時，同時緩慢攪拌；待溶液冷卻后，加入胰蛋白酶，在 40°C反應(yīng)30分鐘；離心3000rpm，5-10分鐘，取上清；在上清中加入NaCl，將蠶絲蛋白沉淀， 離心，得沉淀物；將沉淀物復(fù)溶于PH5. 4-5. 7緩沖液中，透析脫鹽；采用分子篩層析技術(shù)， 分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白質(zhì)自動測序儀測定該多肽的序列為 HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG，純度為 73. 1 % 〇
[0020] 實施例3
[0021] 將上海吉爾合成的多肽添加入乳膏基質(zhì)中，進(jìn)行免疫原性檢測。BALB/c白鼠6只， 雌雄各半，將小鼠背部脫毛，裸露皮膚。分別取不同濃度的雌蠶絲蛋白多肽溶液（0.5,1.0， 2. Omg/ml)以1. 25 μ L/cm2涂敷密度短期1次涂敷，每日涂敷1次，連續(xù)8周，于1-12周 眼眶靜脈叢定點取血每周一次，12000rpm離心2min，分離血漿取上清液，-20°C低溫保存?zhèn)?用。待室溫溶解后，取0.1 ml上清液間接ELISA檢測血清中抗體滴度。以各樣品實際A值 (0D450)比陰性對照血清A值即得RA值，RA彡2. 1即為陽性，將Blood bio-samples樣品 作一系列稀釋后進(jìn)行檢測，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為該樣品的滴度。測定結(jié)果顯示。 1-12周收集的血樣，經(jīng)ELISA間接法檢測多肽誘導(dǎo)抗體均為陰性。由此可見，本發(fā)明得到的 雌蠶絲蛋白多肽無免疫原性。
[0022] 實施例4
[0023] 將實施例1制備的多肽添加入乳膏基質(zhì)中。分別取不同濃度的普通蠶絲蛋白 2. Omg/ml、雄蠶絲蛋白2. Omg/ml、雌蠶絲蛋白多肽溶液（0· 5,1. 0,2. Omg/ml)以L 25 yL/ cm2涂敷密度短期1次涂敷，輕輕拍打至吸收，測定12小時后角質(zhì)層水分含量。數(shù)據(jù)計算： 皮膚水合度變化率（％) =[皮膚水合度（測試時）-皮膚水合度（對照時）]/皮膚水合度 (對照時）X100%。將實驗重復(fù)三次，2. Omg/ml普通蠶絲蛋白、2. Omg/ml雄蠶絲蛋白、0· 5， I. 0,2. Omg/ml雌蠶絲蛋白多肽溶液的皮膚水合度率分別提高了為41. 22、36. 11、43. 15、 54. 26、67. 24%。
[0024] 同時，分別取不同濃度的普通蠶絲蛋白2. Omg/ml、雄蠶絲蛋白2. Omg/ml、雌蠶絲 蛋白多肽溶液（0.5,1.0, 2. Omg/ml)以1.25 μ L/cm2涂敷密度短期1次涂敷，輕輕拍打至 吸收，測定12小時后使用前后表皮的水分經(jīng)皮膚散失，將實驗重復(fù)三次。初始對照的透皮 失水值分別為 19. Ig/(m2 · h)、19. 5g/(m2 · h)、19. 2g/(m2 · h)、19. 4g/(m2 · h)和 19. 3g/ (m2 · h)使用2. Omg/ml普通蠶絲蛋白、2. Omg/ml雄蠶絲蛋白、0· 5,1. 0, 2. Omg/ml雌蠶絲蛋 白多肽溶液至12h時，透皮失水分別達(dá)到14. Og/ (m2 · h)、16. 7g/ (m2 · h)、14. 9g/ (m2 · h)、 12. Ig/(m2 · h)和10. 8g/(m2 · h)，均有不同程度的降低。
[0025] 可見，雌蠶絲蛋白多肽溶液能顯著性提高皮膚水合度率，有效地降低皮膚的透皮 水分蒸發(fā)，具有保濕的作用，且與較普通蠶絲蛋白和雄蠶絲蛋白相比，效果更好。
[0026] 實施例5
[0027] 抑制酪氨酸酶的實驗
[0028] 上海吉爾合成的多肽給藥組反應(yīng)混合物2mL :0.1 M pH6. 8 PBS 0. 9mL加不同濃度 的多肽ImL加0.03%酪氨酸0. lmL。37°C的恒溫箱孵育lOmin，加0.1 mL的酪氨酸酶（350u/ mL)水溶液，將溶液混合均勻，置于37°C的恒溫箱中反應(yīng)25min后，用分光光度計于475mm 測定吸光度值；陰性對照組以等體積的蒸餾水代替多肽用分光光度計于475mm測定吸光度 值；陽性對照組用熊果苷代替多肽用分光光度計于475mm測定吸光度值；0.1 M pH 6.8 PBS 按照2005版《中國藥典》配制。多肽分為l、5、10mg/mL。同時，以熊果苷（10mg/mL)作為陽 性對照組。抑制率％= (1-給藥組/陰性組）*1〇〇% ;每個濃度多肽實驗均重復(fù)統(tǒng)計學(xué)處 理試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（X土s)表示，采用t檢驗，使用Excel軟件做數(shù)據(jù)分析處理。
[0029]
[0030] 皮膚黑素形成是一個十分復(fù)雜的過程，在皮膚黑素的形成過程中由于受到紫外 線、遺傳、內(nèi)分泌、炎癥介質(zhì)、飲食不當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊?，色素代謝異常，皮膚黑素過快增長和 分布不均，就會造成局部皮膚過黑及色素沉著，表現(xiàn)為黃褐斑、雀斑和炎癥后色素沉著等。 酪氨酸酶為含Cu離子的氧化酶，其普遍存在于哺乳動物、植物和微生物中，主要參與生物 體內(nèi)黑色素和其他多酚類物質(zhì)的形成過程，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，酪氨酸酶抑制 劑就是通過抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成，因而可用來預(yù)防和治療色素沉著等。 本發(fā)明通過體外實驗觀察了多肽對酪氨酸酶活性的抑制作用，結(jié)果表明不同濃度的多肽液 對酪氨酸酶活性均有抑制作用，且具有顯著的量效關(guān)系，證實其具有確切的美白祛斑功效。
【主權(quán)項】
1. 種雌蠶絲蛋白多肽，其特征在于，序列為HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雌蠶絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟包括（1)將清 洗、烘干后的雌蠶繭100g剪碎，加入100mL去離子水中；（2)在-80°C速凍；（3)將蠶繭和 水的混合物超聲、粉碎；（4)煮沸1-2小時，同時緩慢攪拌；（5)待溶液冷卻后，加入水解酶， 在20-40°C反應(yīng)30-60分鐘；（6 )離心2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清；（7 )采用鹽析法， 將蠶絲蛋白沉淀；（8)將沉淀物復(fù)溶于pH5. 4-5. 7緩沖液中，脫鹽；（9)采用分子篩層析技 術(shù)，分尚出分子量為2_3KDa的多肽，即得。3. 根據(jù)權(quán)利要求書2所述雌蠶絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟（5)中所述的 水解酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、生姜蛋白酶或合歡蛋白酶。4. 根據(jù)權(quán)利要求書2所述雌蠶絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟（7)中所述的 鹽析法所用的鹽為NH4Cl。5. 根據(jù)權(quán)利要求書2所述雌蠶絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟（8)中所述 的緩沖液為PBS。6. 根據(jù)權(quán)利要求書2所述雌蠶絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟（9)中所述的 分子篩為葡聚糖凝膠。7. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的雌蠶絲蛋白多肽在制備化妝品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雌蠶絲蛋白多肽，涉及生物技術(shù)多肽制備領(lǐng)域。其序列為HHHISAGIPGMACKKKNVWYRG。制備步驟包括將清洗、烘干后的雌蠶繭100g剪碎，加入100ml去離子水中；在-80℃速凍；（3）將蠶繭和水的混合物超聲、粉碎；煮沸1-2小時，同時緩慢攪拌；待溶液冷卻后，加入水解酶，在20-40℃反應(yīng)30-60分鐘；離心2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清；采用鹽析法，將蠶絲蛋白沉淀；將沉淀物復(fù)溶于pH5.4-5.7緩沖液中，脫鹽；采用分子篩層析技術(shù)，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。雌蠶絲蛋白多肽溶液能顯著性提高皮膚水合度率，有效地降低皮膚的透皮水分蒸發(fā)，具有保濕的作用，且與較普通蠶絲蛋白和雄蠶絲蛋白相比，效果更好。
【IPC分類】C12P21/06, A61Q19/00, A61K8/64, C07K14/435
【公開號】CN105017400
【申請?zhí)枴緾N201510451391
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月28日