11 (5，—3’ 方向)
[0188]NH2-tttttttttt (PE)CCGATCTAGTGGATCtgttctt (BHQ3)TGCCTACTGAG
[0189]miR-189SEQ N0.12(5，— 3，方向)
[0190]UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU
[0191]上游引物SEQ N0.13(5’ 一3’ 方向)
[0192]NH2-tttttttttt(FAM)CCGATCTAGTGGATCtgttctt(BHQl)AACTCAGTAATG
[0193]下游引物SEQ N0.14(5’ 一 3’ 方向)
[0194]NH2-tttttttttt(FAM)CCGATCTAGTGGATCtgttctt(BHQl)A+AACCGTTACC
[0195]miR-451SEQ N0.15(5’ 一 3’ 方向)
[0196]AAACCGUUACCAUUACUGAGUU
[0197]上游引物SEQ N0.16(5’ 一 3’ 方向)
[0198]NH2-tttttttttt(PE)CCGATCTAGTGGATCtgttctt(BHQ3)AACTATACAACC
[0199]下游引物SEQ N0.17(5’ 一3’ 方向)
[0200]NH2-tttttttttt(PE)CCGATCTAGTGGATCtgttctt(BHQ3)TGAGGT+AGGAG
[0201]let-7e SEQ N0.18(5，一 3，方向)
[0202]UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 0
[0203]2.不同靶分子對應(yīng)的上游引物和/或下游引物固定于熒光編碼微球的表面
[0204]采用本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域公知的技術(shù)方法，通過上游引物和/或下游引物的Poly(T10)的5’ -末端氨基基團和MicroPlex?熒光編碼微球表面的羧基基團的化學(xué)耦聯(lián)，將引物固定于微球表面，其中:
[0205]miR-105靶分子對應(yīng)的上游引物SEQ N0.1和miR_26a靶分子對應(yīng)的上游引物SEQN0.4同時固定于LC10001號MicroPlex?熒光編碼微球表面，二者的引物分別標(biāo)記FAM和PE焚光報告分子；
[0206]miR-16靶分子對應(yīng)的下游引物SEQ N0.8和miR-189靶分子對應(yīng)的下游引物SEQN0.11同時固定于LC10002號MicroPlex?熒光編碼微球表面，二者的引物分別標(biāo)記FAM和PE焚光報告分子；
[0207]miR-451靶分子對應(yīng)的上游引物SEQ N0.13和下游引物SEQ N0.14、miR_7e靶分子對應(yīng)的上游引物SEQ N0.16和下游引物SEQ N0.17均同時固定于LC10003號MicroPlex?焚光編碼微球表面，二者的引物分別標(biāo)記FAM和PE焚光報告分子。
[0208]3.血清總RNA的提取
[0209]采用商品化總RNA提取試劑盒提取10例人體外周血白細(xì)胞總RNA。
[0210]4.液態(tài)芯片恒溫指數(shù)擴增體系的構(gòu)建
[0211]反應(yīng)體系共計50yL，該體系包括以下組分:50mM NaClUOmM Tris-HClUOmMMgCl2UOO μ g/ml BSA、0.5 單位 Klenow(exo-)DNA 聚合酶(NEB)、2 單位 Nt.AlwI 缺 P 酶(NEB) ,600 μΜ dNTPs (Promega)、步驟I和2中未固定于編碼微球表面的上游和/或下游引物為每種引物50nM，步驟2中表面固定了上游和/或下游引物的LC10001至LC10003熒光編碼微球適量，靶分子是合成的0.1zmol的miRNA靶分子(包括:SEQ N0.3、SEQ N0.6、SEQN0.9、SEQ N0.12、SEQ N0.15、SEQ N0.18)，或者是步驟3制備的10例人體外周血白細(xì)胞總RNA0
[0212]4.靶分子的擴增與熒光檢測
[0213]將上述制備的反應(yīng)體系置于ViiA7實時熒光定量PCR，反應(yīng)條件為:37°C 30分鐘。反應(yīng)完畢后，采用Luminex?200設(shè)備檢測各編碼微球表面的熒光。
[0214]5.檢測結(jié)果與分析
[0215]5.1當(dāng)反應(yīng)體系中只有miR-105靶分子時，只有編碼為LC10001號的熒光編碼微球表面有FAM釋放的可檢測焚光信號，且焚光信號的強度與該革E分子的初始濃度成正比。
[0216]5.2當(dāng)反應(yīng)體系中只有miR-26a靶分子時，只有編碼為LC10001號的熒光編碼微球表面有PE釋放的可檢測焚光信號，且焚光信號的強度與該革E分子的初始濃度成正比。
[0217]5.3當(dāng)反應(yīng)體系中只有miR-16靶分子時，只有編碼為LC10002號的熒光編碼微球表面有FAM釋放的可檢測焚光信號，且焚光信號的強度與該革E分子的初始濃度成正比。
[0218]5.4當(dāng)反應(yīng)體系中只有miR-189靶分子時，只有編碼為LC10002號的熒光編碼微球表面有PE釋放的可檢測焚光信號，且焚光信號的強度與該革E分子的初始濃度成正比。
[0219]5.5當(dāng)反應(yīng)體系中只有miR-451靶分子時，只有編碼為LC10003號的熒光編碼微球表面有FAM釋放的可檢測焚光信號，且焚光信號的強度與該革E分子的初始濃度成正比。
[0220]5.6當(dāng)反應(yīng)體系中只有miR_7e靶分子時，只有編碼為LC10003號的熒光編碼微球表面有PE釋放的可檢測焚光信號，且焚光信號的強度與該革E分子的初始濃度成正比。
[0221]5.7當(dāng)反應(yīng)體系中同時存在本實施例所述的6種靶分子時，編碼為LC10001至LC10003號的熒光編碼微球表面均有FAM和PE釋放的可檢測熒光信號，且熒光信號的強度與各靶分子的初始濃度成正比。
[0222]5.8臨床樣本的檢測結(jié)果表明，10例樣本的miR-105、miR_26a、miR-16, miR-189,miR-451、miR-7e 檢測結(jié)果分別是 5.23 ?7.28 X ΙΟ3、1.27 ?4.38Χ104、2.13 ?3.24 X ΙΟ4、
6.23 ?8.23Χ 103、4.23 ?6.89X 140
[0223]5.9相對于現(xiàn)有的基于雜交的液態(tài)芯片檢測方法，本實施例是核酸擴增與檢測為一體的檢測方法，可在30分鐘內(nèi)完成核酸擴增，擴增產(chǎn)物可直接用于相關(guān)設(shè)備檢測，無需后續(xù)的雜交步驟，總體耗時僅40分鐘左右，遠遠低于現(xiàn)有的基于雜交的類似檢測方法，并且，其靈敏度和特異性等方法學(xué)參數(shù)與現(xiàn)有類似檢測方法具有良好的相關(guān)性。
[0224]對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和專利的實用性。
【主權(quán)項】
1.微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:包括反應(yīng)混合物，反應(yīng)混合物包括以下反應(yīng)成分: ①具有3’-端羥基的miRNA靶分子； ②上游引物和下游引物； ③編碼微球； ④DNA聚合酶； ⑤識別上游引物和下游引物缺口劑識別序列的缺口劑； ⑥三磷酸脫氧核苷酸； ⑦滿足上述DNA聚合酶和缺口劑生物學(xué)活性的離子與緩沖體系；所述的上游引物和下游引物是含有缺口劑識別序列的正義鏈序列，且其5’ 一3’堿基均依次為錨定序列區(qū)、特異性識別miRNA靶分子序列的識別序列區(qū)；上游引物和下游引物的錨定序列區(qū)與miRNA靶分子無同源性，上游引物、下游引物的識別序列區(qū)分別與miRNA靶分子及miRNA靶分子互補鏈的3’-端序列互補； 所述的上游引物和下游引物具有靶分子特異性，且反應(yīng)混合物中包括多種靶分子特異性的上游引物和下游引物，每種靶分子特異性的上游引物和/或下游引物通過其5’ -末端固定于編碼微球的表面，并且，固定于編碼微球表面的上游引物和/或下游引物在其缺口劑識別序列的兩側(cè)(即:5’_端和3’-端)分別標(biāo)記具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用的熒光報告分子和淬滅分子。2.如權(quán)利要求1所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的每種靶分子特異性的上游引物和下游引物同時固定于一種編碼微球的表面； 或者，每種靶分子只有其具有特異性的上游引物固定于一種編碼微球的表面； 或者，每種靶分子只有其具有特異性的下游引物固定于一種編碼微球的表面； 或者，同一種編碼微球的表面同時固定一種或以上靶分子特異性的上游引物和另一種或以上其它靶分子特異性的下游引物。3.如權(quán)利要求1所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的編碼微球包括焚光編碼微球、量子點編碼微球、焚光-磁性編碼微球、上轉(zhuǎn)換發(fā)光編碼微球、拉曼光譜編碼微球，每種編碼微球具有可識別的唯一性標(biāo)志，在同一反應(yīng)體系中同時使用多種編碼微球。4.如權(quán)利要求1所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的編碼微球是熒光編碼微球。5.如權(quán)利要求1?4中任意一項所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的固定于編碼微球表面的上游引物和/或下游引物的錨定序列區(qū)5’ -端還具有多聚堿基，多聚堿基包括多聚胞腺嘧啶堿基(Poly(Tn))或多聚腺嘌呤堿基(Poly(An)),并通過所述多聚堿基的5’ -末端固定于編碼微球的表面。6.如權(quán)利要求5所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的靶分子特異性上游引物和/或下游引物通過固定于編碼微球表面的方式包括:以共價鍵和非共份鍵的結(jié)合方式固定； 或者，通過物理吸附和/或化學(xué)耦聯(lián)方式固定； 或者，具有胺基的烷基或者芳基化合物作為連接肽固定； 或者，具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作為連接肽固定引物； 或者，通過手臂分子固定。7.如權(quán)利要求6所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的固定于相同編碼微球的不同靶分子的特異性上游引物和/或下游引物標(biāo)記具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用的不同的焚光報告分子和淬滅分子。8.如權(quán)利要求1所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述miRNA靶分子的特異性上游引物和/或下游引物的錨定序列區(qū)和/或識別序列區(qū)引入衍生核苷酸，衍生核苷酸包括鎖核酸、肽核酸或硫代修飾堿基。9.如權(quán)利要求1所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述miRNA靶分子的特異性上游引物和/或下游引物的識別序列區(qū)中含有與miRNA靶分子及其互補序列3’ -末端倒數(shù)第二位和/或第三位堿基錯配的核苷酸； 或者，在所述反應(yīng)混合物中加入可抑制非特異性擴增的生物活性分子，包括Taq MutS,RecA010.如權(quán)利要求1所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的DNA聚合酶是具有鏈置換活性的DNA聚合酶； 或者所述的DNA聚合酶不具有鏈置換活性，且在所述反應(yīng)混合物中加入具有鏈置換活性的生物活性分子。11.如權(quán)利要求1?4、6?10中任意一項所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的恒溫的反應(yīng)溫度范圍為37-70°C。12.如權(quán)利要求11所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的恒溫的反應(yīng)溫度為37 °C、55 °C、60 °C或65 °C。13.如權(quán)利要求1?4、6?10中任意一項所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的反應(yīng)時間為10-80min。14.如權(quán)利要求13所述的微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法，其特征在于:所述的反應(yīng)時間為 10min、20min、30min、40min、50min 或 60min。15.如權(quán)利要求1?4、6?10、12、14中的任意一項所述的利用微小RNA的液態(tài)芯片恒溫檢測方法的檢測試劑和試劑盒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微小RNA靶分子的液態(tài)芯片恒溫指數(shù)擴增與檢測方法。本發(fā)明通過將上游和/或下游引物固定在編碼微球的表面，并在其表面固定的引物缺口劑識別序列兩側(cè)標(biāo)記具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用的熒光報告分子和淬滅分子，最終編碼微球表面的靶分子特異性可檢測熒光信號實現(xiàn)多種靶分子的高通量檢測。本發(fā)明克服了miRNA固有屬性對其擴增檢測方法的設(shè)計難度，提供一種基于寡核苷酸引物的液大態(tài)恒溫指數(shù)擴增與檢測系統(tǒng)，能夠在恒定溫度條件實現(xiàn)多種靶分子恒溫指數(shù)擴增和絕對定量的方法。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105002285
【申請?zhí)枴緾N201510460236
【發(fā)明人】黃慶, 府偉靈, 黃君富, 夏涵
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年7月30日